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　　【关键词】 神经元；细胞培养；损伤；疾病模型，动物

　　0引言

　　颅脑损伤是神经外科的危重急症，其致残、致死率较高，是危害人们身心健康的主要疾病之一. 多年来，学者们致力于颅脑损伤病理机制、实验xx的研究，建立了多种颅脑损伤动物模型. 神经元体外培养技术日臻成熟，离体实验较在体实验具有直观、有效和经济等多项优点，作者拟建立一种新的体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤模型.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　孕16~17 d SD大鼠，体质量320~350 g，由第四军医大学实验动物中心提供，台盼蓝购自Sigma公司，LDH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠脑皮层神经元原代培养［1］以戊巴比妥钠（100 mg/kg）常规将大鼠腹腔xx后，无菌状态下取出胎鼠置于冰盒上，解剖显微镜下剥离胎鼠大脑皮层，置于DHanks液中，仔细剥去脑膜及血管组织，吸去DHanks液后，于DHanks液中再漂洗1次，剪碎脑皮质，加入1.25 g/L胰酶消化液于37℃孵箱中消化30 min，吸去消化液，加入含200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，室温下终止消化10 min，DEME培养液漂洗1次，用吸管在含200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中将消化后的组织块吹打成细胞悬液，显微镜下计数，以3×105个细胞/孔将细胞悬液接种于24孔培养板（培养板各孔事先以多聚赖氨酸包被并晾干），每孔加入培养液0.5 mL，培养液中加入青链双抗使其终浓度为100 U/L. 置37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育24 h，每孔加入0.5 μL阿糖胞苷使终浓度为 10 μmol/L，抑制胶质细胞、成纤维细胞及其他非神经细胞过度增殖. 作用24 h后，更换新鲜的xx培养液. 以后隔2~3 d半量更换含200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液.

　　1.2.2体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤鼠脑皮层神经元体外培养7 d，倒置相差显微镜下观察，胞体呈多形性，胞质透亮，周围带有光晕. 自胞体伸出较多突起，突起间相互联系，形成复杂的网络结构. 以细小的微量移液器塑料滴头于各培养孔内划伤培养之神经元，划伤宽度约1 mm. 轻型损伤横竖各划1道，中型损伤横竖各划两道，重型损伤横竖各划3道. 机械性损伤程度判断： ① 体外培养神经元台盼蓝染色，计算细胞存活率： 称取台盼蓝4 g，溶于少量蒸馏水，于研钵中充分研磨，加蒸馏水至100 mL，滤纸过滤，4℃冰箱保存. 使用时PBS稀释成4 mL/L染液，24孔培养板每孔加4 mL/L台盼蓝染液50 μL，染色3~5 min，吸去染液，显微镜下随机选取8个高倍视野，计数蓝染细胞与拒染细胞数，计算细胞存活率. 细胞存活率=拒染细胞数/细胞总数×{bfb}. ② 体外培养神经元LDH含量测定： 损伤组与对照组各时间点留取培养液50 μL， -20℃保存待测. 依试剂盒说明书检测各孔培养液LDH含量.

　　统计学处理： 各组数据以x±s表示，采用多个样本均数间方差分析及两两比较的SNKq检验进行统计学分析.
                                      
　　2结果

　　2.1大鼠脑皮层神经元损伤后细胞存活率体外培养大鼠脑皮层神经元伤后10 min各组细胞存活率无显著差异，伤后30 min各损伤组较对照组细胞存活率均明显下降，伤后1~24 h，中、重型损伤组细胞存活率较轻型损伤组明显下降(Tab 1). 表1体外培养大鼠脑皮层神经元损伤后不同时间各组细胞存活率（略）

　　2.2大鼠脑皮层神经元损伤后LDH含量体外培养大鼠脑皮层神经元，伤后10 min各组间LDH含量无显著性差异，伤后30 min起，各损伤组较对照组LDH含量明显升高. 伤后12 h重型损伤组LDH含量较轻型损伤组增高(Tab 2).表2体外培养大鼠脑皮层神经元损伤后不同时间各组LDH含量（略）

　　.3大鼠脑皮层神经元损伤后病理形态学损伤后不同时间点倒置相差显微镜下观察，伤后即见塑料滴头划伤区域神经元胞体及突起结构xx消失，呈空白区，见较多细胞碎屑，损伤区周围神经元突起受损，远隔部位神经元镜下结构无明显改变. 随着损伤后时间延长，损伤区周围部分神经元胞质透亮度降低，细胞内颗粒物质聚集，甚至胞膜破裂，胞体及突起结构崩解，呈碎屑状. 划伤后24 h，可见划伤区周围新生细小的神经元突起长入划伤区，并见胶质细胞移行进入划伤区域.

　　3讨论

　　神经细胞培养技术是进行神经科学研究非常有用的实验手段，具有实验条件易控，研究对象有较高均一性，研究内容便于直接观察和检测，并能维持较长时间的动态观察，研究费用相对较低，可同时获得大量生物性状相似的研究对象等多项优点.

　　为了进一步阐明神经系统损伤病理生理机制，研究xxxx作用，国内外学者建立了大量体外培养神经细胞损伤模型. 依其致伤模式大致可分为两类，即xx、化学损伤模型和机械损伤模型. xx、化学损伤模型包括谷氨酸［2］, NO［3］, 乙醇［4］，自由基损伤［5］及氧气、能量缺乏性损伤［6］. 机械损伤模型如牵拉损伤［7］，将细胞接种于有弹性的塑料膜上，牵拉塑料膜使细胞受到牵张而损伤；液体冲击伤模型［8］，利用一定流速的液体冲击培养之神经细胞而使之受损；气压损伤模型［9］，将培养之神经细胞施以一定的空气压力，能较好地造成细胞损伤，损伤程度随气压增加而加重；机械划伤模型［10］，利用腰穿针、玻璃棒或小刀机械性划割培养细胞，亦有学者利用微量移液器塑料滴头划伤培养之胶质细胞，观察胶质细胞损伤后反应［11］.
 
　　机械性损伤模型与创伤性脑损伤发病机制最相似，我们利用微量移液器塑料滴头机械性划割培养之神经细胞，发现自伤后30 min，神经元存活率即下降，且随划伤范围扩大，细胞存活率明显下降，培养液上清LDH含量较对照组增加，说明划痕损伤对于神经元确有损伤作用；利用该模型能同时观察到损伤区周围细胞反应，如神经元新生细小突起，胶质细胞移行分裂，细胞破坏崩解等现象；该模型无特殊设备条件，操作简便；避免划伤培养板，影响观察记录. 所以是一种简单有效的体外培养神经元机械性损伤模型.

　　细胞损伤或死亡时，台盼蓝能穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其染为淡蓝色，而活细胞可阻止其进入细胞内，细胞不着色，借此可鉴别细胞活力. LDH是机体能量代谢中一种重要的酶，广泛存在于各组织器官，神经系统损伤可见脑脊液中LDH水平升高，与损伤程度呈正相关. 有学者用LDH水平衡量培养神经细胞损伤程度，并认为LDH释放较台盼蓝染色能更xx反映神经元损伤［10］，与本研究结果并不xx一致，原因尚待进一步讨论.

　　体外培养鼠脑皮层神经元微量移液器塑料滴头机械性划伤模型，可用于创伤性脑损伤/或合并二次脑损伤（如缺氧）的细胞形态学、分子病理学及xxxx学机制研究.

　　【参考文献】

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 Wu QL, Liu EZ, Zhang XT,  et al. Study on increasing the yield and viability of neuron in vitro ［J］. J Harbin Med Univ, 2001; 35(1): 62-63.
 
　　［2］ Yoneda S, Tanaka E, Goto W, et al. Topiramate reduces excitotoxic and ischemic injury in the rat retina ［J］. Brain Res, 2003; 967: 257-266.

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Zhang YH, Zhao N, Yi SY, et al.  Injury model of central neuron by air pressure in vitro ［J］.  J Fourth Mil Med Univ,  2002; 23(5): 423-425.

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