无菌区的xx 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用新洁尔灭擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）xx：先用1‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭。擦拭孵箱时需将里面的细胞取出，但在外面放置的时间不能太长，用酒精棉球擦拭完细胞培养瓶的外壁后方可放入孵箱内。孵箱里水盘内的无菌水也得定期更换，以保持孵箱内的湿度。 3.实验前xx：打开紫外灯照射30~40分钟 ，超净工作台用紫外灯照射后需关闭紫外灯并启动风机使之运转两分钟后再用75%酒精棉球擦洗台面，再进行培养操作。 4.实验后xx：实验后将超净工作台内的物品取出，并用75％酒精（1‰新洁尔灭）擦拭，同时擦拭边台及倒置显微镜的载物台。
无菌操作及注意事项
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。 2.靠近酒精灯火焰操作， 火焰不能太小。 3.器皿使用前必须过火xx。 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。勿碰触吸管 尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器正上方操作实验。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 7.在进行换液或传代操作时，吸管不要触及培养液瓶瓶口以免把细胞带到培养液中，以防止进行其他细胞培养操作时导致细胞污染。 8.容器打开后放在金属倾斜架上取用，尽量不要将瓶盖盖口朝上放置桌面。 9.自己使用自己的液体，不要混用，以免交叉污染 ⒑ 实验人员的无菌准备 ①穿好隔离衣，换好拖鞋 ②带好隔离帽，口罩 ③进入培养室后先用肥皂洗双手，后用75%酒精喷双手及双臂 ⒒处理被污染的细胞时不能在细胞培养室内操作，应拿到外面的操作间进行处理。
玻璃器皿的洗消及包装 1．浸泡：新购的及使用过的玻璃器皿都要彻底清洗，使用过的玻璃器皿应用自来水冲洗后立即浸入新洁尔灭的溶液中，避免器皿内蛋白质干涸后粘附于玻璃上以至难以清洗。浸泡时应将器皿xx浸入水中，无气泡空隙遗留且不能浮于水面。 2. 刷洗：经浸泡后的玻璃器皿需刷洗，用软毛刷和洗涤剂进行洗涤，以去除器皿内外表面的杂质。刷洗时不宜用力过猛，不能留有死角，要特别注意瓶角等部位的洗涤，刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净，并用蒸馏水冲洗2次，晾干。 3．泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），浸泡时应使器皿内部xx充满清洁液，不留气泡，一般浸泡过夜，或至少为6小时以上。浸泡后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗十次以上（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。 细胞培养物品清洗所需配制的清洁液强度通常为次强液。配制：浓硫酸200 ml ,重铬酸钾120 g，蒸馏水1000 ml。配制时要注意做好自身防护，防止皮肤损伤及烧坏衣服。配制过程中，应先将重铬酸钾xx溶解于蒸馏水中，然后缓慢加入浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。 4．烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于xx储存及防止灰尘和再次被污染。 5．高压xx并烘干备用
金属器械洗消 金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）xx，再烘干备用。
胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟。自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗，晾干备用。
塑料制品的清洗 塑料自制品现多是采用xx并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用自来水充分冲洗，再用清洁液浸泡过夜，{zh1}用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。 湿 热 消 毒 湿热xx一般使用高压蒸汽xx器进行xx，在xx前首先要检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干。将包装好的物品装入高压锅内，不应装得太满，盖好盖子，打开开关和排气阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭排气阀，开始升压，气压表指数随之上升，当达到所需压力时，开始记算xx时间。 一般当指针指向15磅时，调节电开关维持30分钟即可。（玻璃培养瓶xx前可将胶帽轻轻盖上，打开xx器的盖后要尽快将胶帽盖紧）xx过程中，要定时检查压力及安全，防止xx及表皮意外事件发生。xx完毕后一定要等指针回到零后再打开排气阀放气，{zh1}打开xx器的盖，以免发生意外。 过滤xxxx 细胞培养使用的一些液体不能采用高压xx的方法进行xx处理，如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等，可采用过滤方法以去除xx等微生物。我们使用的是正压式不锈钢过滤器，过滤较大量培养液时使用，用于小量培养液时，选用2.5㎝直径滤器，以注射器推动为压力面过滤。 这种过滤器一般过滤大量液体时通常使用两层滤膜，上层为0.45um,下层为0.22um,安装时要正确放置，同时注意滤膜的正反面，正面即光面应向上，滤器的上层和下层的相应部位各设有一凹槽以放置一硅胶垫圈便于固定滤膜。安装好滤膜后将螺旋稍微拧松一些，包装好在高压锅内15磅30分钟xx，备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。每次过滤完毕应核实滤膜是否移动或破裂。滤膜为一次性，使用后即可弃去，完后还要清洗过滤器，之后晾干包装。 细胞培养用液的配制与xx 一、PBS的制备与xx 1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.58g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，用10mNaOH调PH到7.2左右，摇匀即成新配制的PBS溶液。 2.移入溶液瓶内待xx：将PBS倒入溶液瓶内，盖上盖子，并拧松放入高压锅内15磅xx30分钟。注意打开高压锅的盖时要尽快将溶液瓶的盖子拧紧。 3、做好标签，放4℃冰箱保存。
二、 胰蛋白酶溶液的配制与xx： 1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO4•12H2O 0.134g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35 g,胰蛋白酶2.5 g，EDTA0.2 g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成含胰蛋白酶0.25%，EDTA0.02%的消化液。用10mNaOH调PH到7.2左右。 2、用针式过滤器（0.22微米微孔滤膜）xx过滤至无菌的溶液瓶内，过滤完后分装至小溶液瓶内，做好标签，至-20℃冰箱内保存，使用时取出一小瓶融化即可。
三、谷氨酰胺的配制： 称取谷氨酰胺粉末2.99g,溶解于100ml去离子水中，充分溶解后过滤xx，分装置小瓶放－20℃冰箱内保存。配制好的培养液如果在4℃冰箱内放置两周后谷氨酰氨大部分已破坏，从而会影响某些细胞的生长而逐渐死亡。因此配制好的超过两周的培养基需重新补加与原来含量相同的谷氨酰氨的量,使用时每100ml培养液加1ml。
四、xx素溶液的配制： 取青霉素（80万U/瓶）5瓶，链霉素（100万U/瓶）4瓶，溶于400ml去离子水中，过滤xx，置－20℃保存，使用时每100ml培养液中加1ml，一般情况下不用加xx素。
五、血清的使用及保存： 未灭活的血清应保存在－20℃冰箱，再使用前需进行灭活处理，即加温到56℃，30min。灭活前应将血清xx融化，先从－20℃冰箱取出放到4℃冰箱内，{zh1}放到室温逐渐使其xx融化，融化时要摇晃血清瓶。灭活后如果在两周内使用不完的话，要将血清放到－20℃冰箱内保存，使用时再取出。
六、RPMI1640培养液的配制： 将RPMI1640培养基干粉（一袋10.4g）溶于准备配制液体总量600ml的去离子水中，冲洗包装袋两次倒入培养液中，再称取Hepes2.38g,NaHCO32g,把溶液定量至1000ml,放磁力搅拌器上搅拌2小时左右，使粉剂充分溶解，用过滤器过滤至无菌的盐水瓶内，过滤完后置4℃冰箱内保存待用。新过滤的培养液要取少量放CO2培养箱做无菌实验，确保无菌后才可使用。 细胞培养时加入所需的血清浓度，一般含10％的血清即可，用10molNaOH调节PH值至7.2～7.4。
七、冻存液的配制： 无血清培养液50ml,血清40ml,二甲基亚砜(DMSO)10ml,配制好的放-20℃保存，使用时取出融化。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时{zh0}戴上手套操作。
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