【摘要】 目的： 研究辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）xx吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）后产生的细胞毒性作用对HeLa细胞增殖及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的影响. 方法：取不同处理时间点体外培养的人宫颈癌HeLa细胞，经不同终浓度的IAA（分别为20，40，60，80，100 μmol/L）和同一终浓度的1.2 mg/L HRP共同处理后，依次用台盼蓝拒染法、生长抑制实验、集落形成实验、流式细胞术、TBA法及QWin550CW显微镜，检测活细胞数、抑制率、集落形成率、增殖指数、凋亡率和

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MDA含量，观察细胞形态学变化. 结果： HRPxx的IAA对HeLa细胞生长及降解MTT的能力均有较强的抑制作用，在一定的浓度范围内，呈现明显的时效和量效关系. 在6, 24, 48和72 h检测细胞周期，处理组随着IAA浓度增加，细胞凋亡率增加，S期和Ｇ2/Ｍ期细胞比率增加，Ｇ0/Ｇ1期细胞比率下降. 随着IAA浓度的增加，HeLa细胞集落生成率逐渐减少，集落体积变小,各处理组蛋白含量显著降低，MDA含量增加，细胞形态学的变化在72 h最明显. 结论：HRPxx的IAA可能通过促进细胞进入分裂期，同时加速脂质过氧化程度的机制来诱导HeLa细胞凋亡.

　　【关键词】 吲哚乙酸；　辣根过氧化物酶；　HeLa细胞；  增殖；  丙二醛；  凋亡

　　0引言

　　吲哚乙酸（indoleacetic acid ，IAA）是高等植物体内最常见的生长xx，能够影响植物细胞的生长、分裂及分化等［1］. 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase HRP）有助于xxIAA产生细胞毒性，从而具有杀灭癌细胞的能力［1，2］. 我们以HeLa细胞为模型，探讨HRPxxIAA后的生物学效应及对脂质过氧化程度的影响，为进一步研制IAA抗肿瘤xx奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　主要试剂和仪器: HeLa细胞株购自中科院上海细胞所. RPMI 1640干粉培养基为美国Gibco公司产品； 新生牛血清为杭州四季青公司产品； 四甲基偶氮唑盐(MTT)和碘化丙啶（PI）为Sigma公司产品； 二甲基亚砜(DMSO)为Amresco公司产品；IAA由上海生化试剂公司提供，4℃保存，临用时用培养液稀释至所需浓度. 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒和丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所. 德国BMG Labtechnologies公司的高功能多通量微板测试系统；美国BD公司的流式细胞仪FACSCalibur；德国Leica公司的QWin550CW型图像信号采集与分析系统.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养RMPI 1640基础培养液中加入100 mL/L的新生牛血清， 1×105 u/L青霉素，100 mg/L链霉素， HeLa细胞株接种在RMPI 1640培养液中，置于CO2孵箱（37℃，50 mL/L）中培养，3～4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验.

　　1.2.2生长曲线的测定空白对照A组为正常生长HeLa细胞；对照B组HeLa细胞单独加入的IAA终浓度20 μmol/L；对照X1组HeLa细胞单独加入的HRP终浓度1.2 mg/L. 实验组X2，X3，X4，X5及X6中IAA的终浓度分别为20，40，60，80，100 μmol/L，HRP终浓度1.2 mg/L，用于xxIAA产生细胞毒性. HeLa细胞2×105个接种于24孔板中，总体积1 mL. 共记数4日，每日取3孔细胞用4 g/L台盼蓝拒染法计活细胞数，绘制细胞生长曲线.

　　1.2.3生长抑制实验(MTT法)HeLa细胞2×104个接种于96孔板中，加入不同终浓度IAA及HRP 1.2 mg/L，总体积200 μL. 分别培养24, 48, 72及96 h，加入MTT 20 μL，4 h后弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，微量振荡器振荡10 min， 高功能多通量微板测试系统(波长570 nm)上测量A值，计算细胞生长抑制率. 计算方法为:抑制率=(1－实验组平均A值/对照组平均A值)×{bfb}.

　　1.2.4流式细胞仪检测细胞周期收集实验组及对照X1组分别培养6, 24, 48和72 h的细胞，1000 r/min离心5 min，PBS洗两次， 轻轻打匀细胞，预冷的700 mL/L乙醇1 mL固定. 检测时PBS洗两次，各样本加入含有Rnase的PI 200 μL，置4℃避光染色30 min，400目尼龙网过滤后，以激发波长488 nm测定，用multicycle软件分析细胞周期，并求出细胞增殖指数(PI)和凋亡率(AP). 计算方法为:PI(%)=(Ｓ+Ｇ2/Ｍ)/(Ｇ1+Ｓ+Ｇ2/Ｍ)×{bfb}.

　　1.2.5集落形成实验细胞浓度每孔50个，接种于24孔培养板中，总体积1 mL，每组设6个平行孔，培养10 d，吉姆萨染色后计算细胞集落数(>50个细胞为1个集落).

　　1.2.6形态学观察细胞接种在放有盖玻片的培养皿中培养，加入HRP及不同终浓度的IAA， 96 h内定时在倒置显微镜下直接观察. 72 h用德国Leica公司的QWin550CW型图像信号采集与分析系统采集照片；同时对培养细胞进行HE染色，摄片.

　　1.2.7硫代巴比妥酸法(TBA)测定MDA收集各实验组及对照X1组培养72 h的细胞，超声破碎制成细胞匀浆，编号后严格按说明书要求操作. 样本蛋白和MDA含量计算公式：蛋白含量(g/L)=测定管A-空白管A〖〗标准管A-空白管A×标准管浓度(g/L)MDA含量(μmol/L)=测定管A-测定空白管A〖〗标准管A-标准空白管A×标准品浓度(10 μmol/L)÷蛋白含量(g/L)

　　统计学处理： 原始数据采用SPSS 11.0统计软件包进行频数统计和重复测量设计方差分析.

　　2结果

　　2.1xx的IAA对HeLa细胞生长的影响以不同剂量处理HeLa细胞时发现，细胞的生长明显受到抑制，生长曲线(Fig 1)显示从传代24 h已经出现实验组生长曲线下移，而单独加入IAA 20 μmol/L和HRP 1.2 mg/L对生长曲线无明显影响.

　　2．2生长抑制实验从Tab 1可以看到HRPxxIAA后，对HeLa细胞降解MTT的能力均有较强的抑制作用. 在处理24 h时，生长抑制表现为低浓度IAA具有较高作用；而在48～72 h，处理组的细胞生长抑制率逐渐呈现剂量效应. 随着处理时间的延长，高浓度组细胞生长抑制率有增加的趋势.表1细胞生长抑制率随时间和xx浓度的变化（略）

　　2．3细胞周期在6, 24, 48和72 h细胞周期的检测结果显示，Ｇ0/Ｇ1期细胞总数有下降趋势，Ｇ2/Ｍ期和S期显著增多， AP增加，DNA直方图上出现典型的亚二倍体凋亡峰. 方差分析结果显示，在48 h时间段G2/M期在IAA 各浓度之间出现明显的差异，PI及AP等之间无显著性差异.

　　2．4xx的IAA对HeLa细胞集落形成的作用当HRP 1.2 mg/L,随着培养时间延长，高浓度的IAA使HeLa细胞集落生成率逐渐减少，且集落体积变小. 集落生成抑制作用在72 h明显，IAA 100 μmol/L与HRP 1.2 mg/L作用至10 d，集落形成明显受抑，只有很少的细胞形成克隆团，之后生长减缓以至死亡(Fig 2).

　　2．5HeLa细胞的形态学变化倒置显微镜下直接观察，HeLa细胞体积随IAA浓度增加而变小，细胞边角减少，逐渐变为圆形，胞内颗粒增多，胞膜完整，部分细胞膜表面有小泡形成，培养液中有许多漂浮的呈虫蚀样及桑椹样细胞，72 h后上述改变更为明显. QWin550CW型图像信号采集与分析系统示72 h上述改变，放大20倍(Fig 3A～H)，X1和X6组放大40倍(Fig 3I,J). A组、B组和X1组细胞无显著改变. HE染色显示:细胞体积明显缩小，梭状边角减少，细胞膜上出现小泡及胞膜皱缩，胞质变少，红染，细胞核明显固缩, X1组和X6组见Fig 4，5.

　　2．6TBA法测定MDA结果随着IAA浓度的增加，处理各组样本蛋白含量显著降低，MDA含量升高，在72 h明显（Tab 2）.表2测定72 h各组HeLa细胞上清液中蛋白和MDA（略）

　　3讨论

　　近年来，寻找有效抗肿瘤xx成为研究的热点. 1998年Folkes等［2］发现，IAA和HRP结合后对V79小鼠细胞有细胞毒作用，而单独加入IAA或HRP均无细胞毒作用. 此后有文献报道［3］ HRP有助于xxIAA产生杀灭癌细胞能力， 而且人体可以耐受较大剂量IAA. Kim等［4］报道在一定的浓度范围内，xx的IAA对人黑色素瘤G361细胞生长有较强的抑制作用，呈现明显的时效和量效关系，而抗氧化剂可以阻止这一过程. 本实验HeLa细胞经IAA和HRP处理后作细胞培养，显示生长曲线下移，有增殖抑制趋势，而单独加入IAA或HRP均无抑制效应，与报道一致.  MTT法是从能量代谢角度观察细胞增殖情况，xx的IAA对HeLa细胞降解MTT的能力有较强的抑制作用. 细胞凋亡与肿瘤发生、发展与消退有密切关系，某些抗肿瘤xx抗肿瘤作用的强弱与它们诱导肿瘤细胞凋亡的活性呈正比.  因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为寻找抗肿瘤xx的新靶点，以及评价疗效的一项新指标［5,6］. 流式细胞术分析发现在细胞增殖周期中，Ｇ0/Ｇ1期、S期以及Ｇ2/Ｍ之间存在着影响细胞周期进行的控制点，而xx可能通过调控这些控制点来影响细胞增殖，不同的xx可影响细胞周期的不同阶段. Greco等［7］用HRP cDNA转染人膀胱癌T24细胞，观察到HRPxx的IAA 对细胞分裂周期各阶段均有抑制作用. 本研究结果与之不同，对照组G1期在6 h和24 h高于其他处理组，在48 h和72 h保持平稳，而S期和Ｇ2/Ｍ期细胞总比率随IAA浓度增加而有所降低. 处理组凋亡率增加表明，对HeLa细胞的杀伤作用增强. 以上结果暗示，IAA的杀伤作用可能主要发生在细胞增殖期. 氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤. HRPxxIAA产生活性氧［8］，而MDA是植物中鉴定IAA起源的主要产物［9］. MDA水平可直接反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度［10］. 自由基引发的氧化损伤与其致癌作用密切相关，Folkes等［11］研究发现IAA及其许多衍生物如3亚甲基2羟吲哚等被HRP氧化，导致细胞损伤， DNA断裂，培养的哺乳动物细胞的集落形成能力丧失. 本研究与报道相符，随着IAA浓度的增加，xx的IAA可有效降低HeLa细胞集落形成率. 处理各组样本蛋白含量显著降低，MDA含量升高，并呈现明显的剂量效应，提示自由基反应增强，HeLa细胞损伤的程度逐渐加重，肿瘤特性降低.

　　【参考文献】

　　［1］ Veitch NC. Horseradish peroxidase: A modern view of a classic enzyme［J］. Phytochemistry, 2004; 65(3):249-259.

　　［2］  Folkes LK, Candeias LP, Wardman P. Toward targeted "oxidation therapy" of cancer: Peroxidasecatalysed cytotoxicity of indole3acetic acids［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1998;42(4):917-920.

　　［3］ Wardman P. Indole3acetic acids and horseradish peroxidase: A new prodrug/enzyme combination for targeted cancer therapy［J］. Curr Pharm Des, 2002; 8(15):1363-1374.

　　［4］ Kim DS, Jeon SE, Park KC. Oxidation of indole3acetic acid by horseradish peroxidase induces apoptosis in G361 human melanoma cells［J］. Cell Signal, 2004;16(1):81-88.

　　［5］  Makin G, Dive C. Recent advances in understanding apoptosis: New therapeutic opportunities in cancer chemotherapy［J］. Trends Mol Med, 2003; 9(6):251-255.

　　［6］ 裘秀春, 于翠娟, 许彦鸣, 等. 截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用［J］. 第四军医大学学报, 2003;24(21): 1963-1966.

　　Qiu XC, Yu XJ, Xu YM, et al. Proapoptotic effect of a truncated human bid fusion protein on HeLa cells［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(21): 1963-1966.

　　［7］ Greco O, Dachs GU, Tozer GM, et al. Mechanisms of cytotoxicity induced by horseradish peroxidase/indole3acetic acid gene therapy［J］. J Cell Biochem, 2002; 87(2):221-232.

　　［8］  Niwa T, Ishii S, Hiramatsu A, et al. Oxidative reaction of oxindole3acetic acids［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 2003; 67(9):1870-1874.

　　［9］ Gazarian IG, Lagrimini LM, Mellon FA, et al. Identification of skatolyl hydroperoxide and its role in the peroxidasecatalysed oxidation of indol3yl acetic acid［J］. Biochem J, 1998; 333(Pt 1):223-232.

　　［10］ 李扬, 熊利泽, 秦绪军, 等.参附注射液对幕上肿瘤手术患者血清SOD活性和MDA含量的影响［J］. 第四军医大学学报, 2003;24(16);1507-1509.

　　Li Y, Xiong LZ, Qin XJ, et al. Effect of shenfu injection on the super oxide dismutase activities and malondialdehyde levels in sera of supratentorial cerebral tumor patients during  operation［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(16);1507-1509.