实验题目：荧光分光光度法测定维生素B2的含量

一、实验目的

1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。

2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。

二、实验原理
维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。其结构式为：

由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

    维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH＝6~7的溶液中荧光强度{zd0}，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

    在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：

F＝2.303ФI0εbc

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：

F=Kc

这是荧光光语法定量分析的依据。

三、主要仪器与试剂

主要仪器：荧光分光光度计；1cm石英皿；25mL容量瓶；1mL、5mL移液管

试剂：维生素B2标准溶液：10.0μg/mL

      待测样品溶液

四、实验步骤

1、系列标准溶液的制备

取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL) 0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL分别置于25mL的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。得浓度依次为0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、0.80μg/mL、1.00μg/mL的一系列维生素B2标准溶液。待测。

2、激发光谱和荧光发射光谱的绘制

设置λem＝540nm为发射波长，在250~500nm范围内扫描，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光谱图上可找出其{zd0}激发波长λex。

    从得到的激发光谱中找出{zd0}激发波长，在此激发波长下，在450~700nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其{zd0}荧光发射波长λem。数据记录于表1中。

3、标准溶液及样品的荧光测定

    将激发波长固定在{zd0}激发波长，荧光发射波长固定在{zd0}荧光发射波长处。测量上述系列标准维生素B2溶液的荧光发射强度。数据记录于表2中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。 

  在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度，计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。

五、数据记录与结果分析

①、维生素B2激发光谱图： 

②、维生素B2荧光发射光谱图：

③、表1：激发光谱和荧光发射光谱绘制过程中实验数据记录

④、表2：标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度数据记录：

⑤、系列标准溶液浓度与荧光发射强度的标准曲线图：

由计算机处理得标准曲线方程为y=841.05x+104.57

相关系数r=0.99822

则待测溶液的浓度c =(208.0-104.57)/841.05=0.12μg/mL

六、问题讨论

1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？

答：原因是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。

2、维生素B2在pH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？

答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生素B2的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。