摘要：综述了硝酸银在离体培养中对植株再生的影响，及其在遗传转化中的作用，并对硝酸银作用的生理生化机制进行了探讨。
　　关键词：硝酸银；离体培养；转化；机理
　　中图分类号：Q813
　　文献标识码：A
　　文章编号：1673-0925(2008)01-0062-05
　　
　　随着植物基因工程技术的发展，转基因技术已经逐渐成为植物定向遗传改良的重要手段。但是，许多植物的遗传转化研究中存在的再生困难问题严重制约了转基因技术的广泛应用。本文对影响离体植株再生的一个重要因子——硝酸银进行研究，并对硝酸银作用的生理生化机制进行了探讨。
　　
　　1　硝酸银对离体植株再生的作用
　　
　　硝酸银在离体植株再生中的使用含量一般为1-10mg·L^-1，含量过高常会产生毒害作用。培养物应避免长期在含有硝酸银的培养基上培养，否则再生植株会出现畸形生长。研究表明硝酸银对许多单子叶和双子叶植物离体形态发生有促进作用。硝酸银能促进小麦、玉米愈伤组织再生植株。杜建芳等研究表明，用硝酸银处理小麦离体细胞2d可以使再生率显著提高。在一定浓度范围内，硝酸银有利于玉米愈伤组织诱导。Chi et al也证实在培养基中加入适量的硝酸银能促进玉米愈伤组织的器官发生及体细胞胚胎发生。杨会等研究表明，对于一些特殊基因型玉米愈伤组织的诱导，必须添加硝酸银。王景雪等发现在添加2-4mg·L^-12，4-D条件下，硝酸银能显著提高玉米胚性愈伤组织的比率。孙红炜等对几个玉米杂交种的幼胚进行离体培养，结果表明在培养基上添加8mg·L^-1硝酸银可以显著提高玉米的再生率。肖莉杰等认为硝酸银在玉米愈伤组织的诱导及其质量的提高方面有一定的作用。祝红艺等以非洲菊试管苗叶片为外植体，在培养基中添加一定浓度的硝酸银溶液后，其品种的芽分化频率有较大提高，以0.5-2.0mg·L^-1处理较为适宜。王文星等研究表明，在离体培养基中添加1-5mg·L^-1的硝酸银能提高烟草芽分化率，尤以加入5mg·L^-1的硝酸银对芽再生的促进作用最明显。YANG et al研究表明，硝酸银在马铃薯叶片愈伤组织诱导阶段和芽再生阶段，能显著提高芽再生频率，尤其在愈伤组织诱导阶段可直接形成芽而不必经过愈伤组织形成过程。黄玉吉比较了附加不同浓度的硝酸银对香蕉组织培养的出芽率的影响，结果表明，在附加2mg·L^-1硝酸银的芽诱导培养基中，以香蕉横切薄片为外植体培养的出芽率{zg}，达93.33％。在双子叶植物中，硝酸银对向日葵、拟南芥，以及许多芸苔属植物的离体植株再生也有促进作用。Williams et al报道，硝酸银不仅可促进抱子甘蓝愈伤组织的生长，使其长期培养，而且能提高愈伤组织再生植株的能力。何小兰等研究表明，硝酸银浓度对甘蓝型油菜子叶柄外植体不定芽的再生频率、外植体不定芽平均数和不定芽平均长度均有明显影响。唐桂香等研究表明，2.5mg·L^-1硝酸银可明显提高甘蓝型油菜无菌苗子叶的植株再生频率，使芽再生频率和每一外植体再生芽数分别达到43.30％和2.77。杜虹等研究表明，大白菜芽再生率从28.2％(无添加硝酸银)提高到71.7％(添加2mg·L^-1硝酸银)。范永梅等在建立冰糖橙胚性细胞系过程中发现，在继代培养基中添加5mg·L^-1的硝酸银有利于小而弱的胚状体基部形成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织发生率达28％。钟名其等在分化培养基中添加1-2mg·L^-1硝酸银，发现它对桑树叶片组织培养中不定芽的分化具有明显的促进作用。
　　硝酸银不仅还可防止培养物的褐化与玻璃化。张淑红等发现，用0.6mg·L^-1硝酸银可抑制马铃薯叶肉原生质体的褐化，从而提高其细胞分裂频率。
　　综上所述，硝酸银的作用主要表现在以下几个方面：(1)促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎发生；(2)促进一些再生困难种芽的产生；(3)增加外植体产生的不定芽数量及提高植株再生频率；(4)防止褐变。
　　
　　2　硝酸银在遗传转化中的应用
　　
　　植物转基因研究表明，要成功地获得转化植株，必须有2个条件：首先是外源T-DNA能导入植物的细胞中；其次这个细胞能被诱导产生不定芽并最终发育成完整的植株。由此，硝酸银成为植物遗传转化中最常用的植物组织培养添加剂。砸遗传转化过程中，Deblock et al报道，硝酸银对于转化的油菜及甘蓝外植体芽的再生是必需的，在培养基中应尽早添加适量硝酸银。陈永文的研究结果表明，在甘薯的遗传转化中，预培养基中附加硝酸银不利于转化，而在共培养基中加硝酸银对转化有促进作用。程振东等研究表明，硝酸银可提高农杆菌转化甘蓝型油菜的频率。Perl et al采用PEG法将CAT基因导入马铃薯原生质体进行瞬间表达，发现用Ca(NO₃)₂稀释时，添加硝酸银可以提高瞬间表达的水平。刘金华等在大豆转化中，在共培养培养基中加入不同浓度的硝酸银，发现硝酸银对提高大豆的转化率具有明显效果；2mg·L^-1的硝酸银最有利于大豆的转化，GUS表达率达到68.1％。钟名其等在抗性筛选培养基中添加2mg·L^-1硝酸银，桑叶盘褐化死亡率下降7.2％，抗性芽分化率提高3.9％，外源基因转化频率提高9.6％，“假阳性”转化率下降42.5％。王亚琴等分别以籼稻、粳稻2种类型的成熟种子为外植体，研究了不同浓度硝酸银在水稻农杆菌转化中的作用。结果表明，在农杆菌转化前添加硝酸银可以提高愈伤组织诱导率，最适含量为8—10mg·L^-1；但对愈伤组织的分化没有明显的促进作用；转化后添加低浓度的硝酸银可以减轻愈伤组织的褐化，提高抗性愈伤率和绿苗分化率，硝酸银最适含量为2-8mg·L^-1。他们也发现，无论在转化前还是转化后，添加高浓度的硝酸银对水稻愈伤组织的分化都具有毒害作用。高武军等发现硝酸银对于油菜下胚轴和子叶芽的分化是必需的，但是当硝酸银浓度超过某一临界值时又会抑制愈伤组织的形成和外植体芽的分化；未经农杆菌处理的外植体芽的分化所需的最适宜的硝酸银浓度为20μmol·L^-1，而经农杆菌处理过的外植体分化所需的最适宜的硝酸银浓度为30μmol·L^-1。μ贾炜珑等利用基因枪转化玉米，结果表明，在筛选过程中加入硝酸银有利于抗性绿苗的分化，分化率提高21.9％。陈永文等在共培养基中附加硝酸银能极大地促进甘薯的遗传转化；在不含硝酸银的预培养基中，预培养的外植体经根癌农杆菌感染后，在其培养阶段添加硝酸银能有效地诱导这些细胞分化出不定芽，从而提高了不定芽的产生频率和Kan芽的获得率。当共培养基中硝酸银的含量为6mg·L^-1时，这种作用最明显，卡那霉素抗性芽的获得率达到{zd0}值(27.5％)。而培养基中硝酸银的含量≥10mg·L^-1时，外植体因硝酸银的毒素作用而黄化、褐化，最终坏死。黄玉吉将共培养后的香蕉薄片接于附加2mg·L^-1硝酸银的筛选培养基中，褐变乃至死亡的薄片比在未添加硝酸银的培养基中下降9.00％，抗性芽分化率提高7.00％；经硝酸银处理的抗性芽的分化时间比未经硝酸银处理的抗性芽缩短5d左右。

　3　硝酸银作用机制
　　
　　3.1　硝酸银对乙烯活性具有抑制作用
　　外植体受到创伤后，其创伤部位的细胞会产生大量自身保护物质——乙烯，而乙烯对细胞的分化和器官的形成具有抑制作用。如芸苔属植物因其产生大量乙烯而导致植株畸形生长、发育，以及离体培养时的植株再生受抑制。由于植物在受到胁迫(如机械损伤、病菌侵染等)后，其体内乙烯含量常常会升高，而在组织培养中高含量的乙烯会引起外植体褐化死亡和植株畸形发育。Ag^＋是一种较好的乙烯活性抑制剂。早期研究也表明，Ag⁺、Co⁺等金属离子是乙烯合成的抑制剂。Beyer认为，Ag^＋可干扰乙烯与其受体的结合，因而它是一种乙烯作用抑制剂。Yang认为，Ag⁺在ACC-乙烯形成中起抑制作用。研究表明Ag⁺抑制乙烯活性的机理可能是通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白而阻止乙烯与其受体结合，从而促进器官发生和体细胞胚胎发生。研究表明，在番茄子叶的组织培养中外植体释放的乙烯越少，其鲜重增加越多，乙烯不但抑制外植体芽分化，也抑制再生苗的生长；白菜(B.campestrisssp.chinensis)的子叶在有Ag⁺存在的条件下，芽再生率从原来的20％—30％提高到70％-80％。
　　
　　3.2　硝酸银对乙烯及多胺合成的影响
　　对Ag⁺作用机制的研究表明，Ag⁺与乙烯及多胺的生物合成及代谢密切相关。研究表明乙烯抑制器官发生及体细胞胚胎发生，而多胺对其具有促进作用。乙烯的生物合成与多胺的生物合成是相互抑制的，两者都以SAM(S.腺苷甲硫氨酸)作为共有前体。多胺可通过抑制蛋白质合成，即降低ACC合成酶及ACC浓度来抑制乙烯的产生。Smith et al研究发现ACC可明显抑制豌豆顶芽的生长，降低多胺含量，而AVG(一种乙烯合成抑制剂)显著提高顶芽Put浓度。多胺不仅能通过抑制内源乙烯合成而延缓衰老，也抑制外源乙烯所诱导的衰老，这表明多胺不仅能影响乙烯的合成，也能影响乙烯的作用。虽然多胺和乙烯的关系比较复杂，但二者之间的相互作用是存在的。它们可能存在以下几方面的相互作用：(1)多胺可影响ACC合成酶和ACC氧化酶的转录水平，进而影响ACC的合成和转化；(2)多胺通过影响膜系统的物理性质来影响膜上ACC氧化酶的性质，阻止ACC转化为乙烯；(3)多胺通过猝灭自由基，提高膜保护酶系统活性，抑制乙烯的产生。
　　Roustan et al研究表明，硝酸银并非抑制乙烯的合成，而是由于Ag⁺的存在，乙烯不能干扰多胺的合成，从而使ADC酶活性提高45％—54％。故有些研究者认为，硝酸银是通过促进多胺的合成提高器官发生和体细胞胚胎发生的频率。Chi et al以大白菜为材料，研究了硝酸银对子叶芽再生中乙烯和多胺变化的影响。结果表明，硝酸银不会抑制乙烯的合成，而是促进ACC合成酶活力和ACC的积累，同时伴随乙烯释放量的增加，Ag⁺促进植株再生的能力亦不受CEPA(z-chloroethylphosphonic acid，一种促进乙烯释放的因子)影响(或影响较小)。加入Ag⁺使内源ACC合成酶活性提高，以及ACC及乙烯量增加的原因，可能是培养基中过量的Ag⁺导致一种常见的对植物的胁迫效应。研究又表明，虽然外源多胺可促进植株再生，但Ag⁺在促进植株再生上似乎与多胺代谢无关。
　　
　　3.3　硝酸银使植物细胞的感受态增强
　　对根癌农杆菌遗传转化机制的研究表明，植物细胞感受态与转化频率有关。植物细胞处于对农杆菌良好的感受态时才能有效地接受外源DNA并使其得以整合和表达。Potrykus et al研究表明，在植物转化时，适当的硝酸银处理会使植物细胞的感受态增强，此外，这些处于良好感受态的细胞也易分化产生不定芽。
　　
　　4　展望
　　
　　硝酸银不仅能促进愈伤组织的器官发生和体细胞胚胎发生，增加外植体产生不定芽的数量及提高植株再生频率等，而且在遗传转化中能提高植物的转化率，并有抑菌作用。硝酸银在许多单子叶和双子叶植物离体再生和遗传转化中都具有重要作用，但其在其他植物的离体再生和遗传转化中的作用还需进一步研究。硝酸银在遗传转化中能提高植物的转化率，但硝酸银对遗传转化过程是否有直接影响还有待进一步研究。
　　目前，对硝酸银作用的相关机制的研究很多，但是说法不一。有关硝酸银促进离体植株再生和提高遗传转化效率的生理生化机制还需深入研究。