【关键词】肝功能衰竭，急性； 肿瘤坏死因子α； 罗格列酮

Study on the protective effect and related mechanisms of Rosiglitazone on acute hepatic failure in mice   CHEN Hai-ou, XIE Yu-tao, FU Ai.

【Key words】Liver failure, acute;  Tumor necrosis factor alpha;  Rosiglitazone

【First author’s address】Department of Infectious Disease, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China

Corresponding author: XIE Yu-tao, Email: drxieyutao@ tom.com

罗格列酮为过氧化物酶增殖物活化受体-γ(PPAR-γ)的合成型配体，对PPAR-γ有高度选择性。研究表明肝组织也有PPAR-γ的表达，且PPAR-γ的功能状态与脂肪肝、肝脏炎症与纤维化，甚至肝癌的发生有密切关系。目前已有罗格列酮xx慢性肝病的研究报道，如抗肝纤维化、xx非酒精性脂肪肝等[1-2]。但国内外鲜见xx急性肝衰竭（AHF）的相关报道。我们用D-氨基半乳糖（D-GalN）联合脂多糖（LPS）腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型，并以罗格列酮干预，观察它对AHF是否有保护作用，同时研究其可能的作用机制。

一、材料与方法

1．实验动物：雄性清洁级昆明小鼠，6～8周龄，20g左右，购自中南大学湘雅医学院动物实验中心。

2. 主要试剂：LPS购自美国Sigma公司，D-GalN购自重庆医科大学生物医学工程研究室，罗格列酮片购自天津葛兰素-史克制药公司。逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司，总RNA分离试剂盒购自美国MRC公司。肿瘤坏死因子（TNF）α上游引物为5′-GGTGCCTATGTCTCAGC CTCTT-3′，下游引物为5′-GCTCCTCCACTTGGTGGTT T-3′，扩增片段长度225bp；半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白（Caspase）-3上游引物为5′-GGAGAAATTCAAAGGAC GG-3′，下游引物为5′-AACAAAACAGAAACACGCCC-3′， 扩增片段长度271bp ；3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）上游引物为5′-ACCACAGTCCATGACATCAC-3′，下游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′， 扩增片段长度452bp。各引物均由上海生工生物工程公司合成。

3. 小鼠急性肝衰竭模型制备：据预实验以600mg/kg D-GalN联合10μg/kg LPS腹腔注射以构建小鼠急性肝衰竭模型，并经肝组织HE染色证实AHF造模成功。

4. 动物分组与xx干预：小鼠100只，随机分5组，每组20只，按上述方法构建动物模型：造模前2h分别以罗格列酮5、10、20、50mg/kg灌胃，对照组以等量等渗盐水灌胃，观察小鼠24h存活率以选择{zj0}干预剂量。据实验结果选择罗格列酮20mg/kg为干预剂量，取小鼠60只，随机分为正常组、模型组、干预组每组20只。模型组和干预组于造模前2h分别以等渗盐水、罗格列酮20mg/kg灌胃，正常组在各时间点皆以等渗盐水灌胃。造模后6h，每组随机选5只小鼠去眼球采血以检测血清氨基转移酶；5只小鼠断颈处死后取肝组织提取总RNA行RT-PCR和HE染色。

5. RT-PCR检测肝组织TNFα、Caspase-3 mRNA的表达：肝组织匀浆, 按Trizol说明书提取总RNA，42℃逆转录,产物用于PCR扩增。PCR条件: 94℃ 5min；94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 60s，30个循环；72℃ 10min。取PCR产物5μl行20g/L琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像分析系统（购自上海天能科技有限公司）进行半定量分析，以GAPDH与各目的片段的吸光度值确定其表达水平。

6. 统计学分析：计量资料数据采用均数±标准差（x-±s）表示，两样本均数比较采用t检验，方差不齐时采用秩和检验；率的比较采用χ2检验。采用SPSS13.0统计软件包进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1．不同剂量罗格列酮对D-GalN/LPS小鼠24h存活率的影响：罗格列酮20mg/kg时，24h存活率为60%，与对照组比较，差异有统计学意义（χ2＝6.667，P＝0.01）；罗格列酮50mg/kg时的存活率为65％，与20mg/kg组比较，存活率未明显提高（表1），故选择罗格列酮20mg/kg作为干预剂量。

表1 （略）

2．罗格列酮对D-GalN/LPS小鼠血清氨基转移酶的影响：经Levene法方差齐性检验，Levene statistic＝8.471，P＝0.005（ALT）；Levene statistic＝34.967，P＝0.000(AST),方差不齐，改用秩和检验。干预组ALT及AST均较模型组降低（Menn-Whitney法U＝0.000；Wilcoxon法W＝15.000，P值均＜0.01）。

3．肝组织HE染色：正常组：肝小叶结构清晰，肝细胞未见坏死，汇管区无炎性细胞浸润。模型组：肝索解离，大面积肝组织溶解，见大量嗜酸性坏死和炎性细胞浸润，肝窦内见红细胞淤积。干预组：结构正常，以细胞变性为主，坏死较少，偶见双核及嗜酸样病变，肝细胞损伤程度较模型组明显减轻。见图1。

4. 罗格列酮对D-GalN /LPS小鼠细胞因子mRNA表达水平的影响：正常肝组织TNFα mRNA（t＝-5.451，P＝0.001）和Caspase-3 mRNA（t＝-5.766，P＝0.000）的表达水平较模型组低，差异有统计学意义；以罗格列酮干预后，可明显下调TNFα mRNA（t＝-2.988，P＝0.017）和Caspase-3 mRNA（t＝-2.706，P＝0.027）的表达水平。见图2，3。

三、讨论

TNFα一方面参与机体的免疫防御机能，选择性杀伤肿瘤细胞，另一方面介导休克、炎症反应、组织损伤等病理生理反应[3]。有研究表明TNFα与肝细胞凋亡有着密切关系，且在AHF过程中起着重要作用[4]。TNFα与肝细胞膜上其受体结合，诱发细胞凋亡是内毒素性肝衰竭模型的重要机制，预先使用抗TNFα IgG可xx阻断LPS诱导的小鼠肝细胞凋亡和坏死[5]。本研究结果显示正常肝组织仅有少量TNFα mRNA的表达，模型组TNFα mRNA的表达较正常组显著增加，说明TNFα和肝细胞炎症坏死有密切关系，D-GalN/LPS可能通过上调TNFα的表达而导致肝细胞炎症坏死，甚至AHF。

大量实验证实在AHF中,除炎症坏死外,也存在凋亡。凋亡是蛋白酶级联切割过程结果，Caspase-3处于该过程的核心位置，其过量表达可诱发凋亡，因此许多学者将活化Caspase-3的出现作为细胞凋亡的标志。有研究证实TNFα能xxCaspase-3蛋白酶活性并能诱发肝细胞凋亡。Ku..nstle等[6]研究也表明广谱的Caspase抑制剂可阻断TNFα介导的肝细胞毒性。本研究结果显示，正常肝组织仅有少量Caspase-3 mRNA表达，模型组Caspase-3 mRNA的表达较正常组显著增加，D-GalN/LPS可能通过上调TNFα的表达，继而上调Caspase-3的表达导致肝细胞凋亡。

罗格列酮除降糖作用外，还有改善血流动力学、影响细胞增殖和转型、xx、抗氧化和抗凋亡等作用。本研究结果显示，罗格列酮可降低小鼠AHF的24h死亡率，与对照组比较，死亡率下降40个百分点；可降低血清氨基转移酶水平；可改善肝组织学。所以我们认为罗格列酮对小鼠AHF有保护作用。为进一步探讨罗格列酮对AHF保护作用的可能机制，本研究检测了肝组织TNFα、Caspase-3 mRNA的表达，结果显示干预组上述2种细胞因子的表达较模型组明显减弱，差异有统计学意义。推测罗格列酮可能是通过下调TNFα、Caspase-3的表达使肝细胞炎症坏死减轻，凋亡减少，从而对AHF起保护作用。至于罗格列酮如何下调上述因子，有待于更深入的研究。

参  考  文  献

[1]Guo YT, Leng XS, Li T, et al. Effect of rosiglitazone, a ligand of peroxisome proliferator-activated receptor gamma, on the biological characters of hepatic stellate cells. Jiepou Xuebao, 2005, 36: 150-153. (in Chinese)

郭晏同，冷希圣，李涛,等.过氧化物酶体增殖物活化的受体γ特异配体罗格列酮对肝星状细胞生物学特性的影响.解剖学报,2005,36:150-153.

[2]Neuschwander-Tetri BA, Brunt EM, Wehmeier KR, et al. Improved nonalcoholic steatohepatitis after 48 weeks of treatment with the PPAR-gamma ligand rosiglitazone. Hepatology, 2003, 38: 1008-1017.

[3]Ding WX, Yin XM. Dissection of the multiple mechanisms of TNF-alpha-induced apoptosis in liver injury. J Cell Mol Med, 2004, 8:445-454.

[4]Nguyen NT, Banskota AH, Tezuka Y, et al. Hepatoprotective effect of taxiresinol and (7'R)-7'-hydroxylariciresinol on D-galactosamine and lipopolysaccharide-induced liver injury in mice. Planta Med, 2004, 70: 29-33.

[5]Nowak M, Gaines GC, Rosenberg J, et al. LPS-induced liver injury in D-galactosamine-sensitized mice requires secreted TNF-alpha and the TNF-p55 receptor. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2000, 278: R1202-1209.

[6]K黱stle G, Hentze H, Germann PG, et al. Concanavalin A hepatotoxicity in mice: tumor necrosis factor-mediated organ failure independent of caspase-3-like protease activation. Hepatology, 1999, 30:1241-1251.