2.1.2 特点

其优点包括（1）成本低、突变频率高、突变谱广，并诱发产生新性状、新类型。（2）可使个别基因发生突变，引起花卉形态结构和生理生化多方面的变异，缩短育种时间。

其缺点是对染色体伤害较大，致死突变较多。

2.1.3 机理

物理诱变的主要原因包括两方面^[7]：一是辐射后引起遗传物质的突变，如染色体的畸变、ＤＮＡ分子的变异。二是ＲＮＡ、蛋白质的生物合成受到抑制，生长素及酶等生理活性物质的代谢受到破坏，表现出细胞死亡、细胞突变。

用⁶⁰Ｃｏ-γ射线植物材料后，辐射产生生理效应表现在叶绿素ａ、叶绿素ｂ、类胡萝卜素、类黄酮含量和ＳＯＤ、ＣＡＴ活性发生改变。

辐照材料的选择是诱变育种成败的关键之一^[6]。诱变育种材料选定后重要的一步就是采取适宜的辐射剂量。一般认为，低剂量的辐射能刺激愈伤组织的生长和植株再生，随着剂量的增加，存活率逐渐下降，突变频率则逐渐上升。这是因为低剂量和高剂量辐射都能对观赏植物引起伤害，而低剂量辐射所致的伤害可引起一系列修复酶的活动，进而减轻辐射损伤，同时修复系统的过分活动还会引起加速生长;而高剂量的辐照，则使植物细胞分裂几乎停止，xx靠细胞伸长来生长通常采用半致死剂量(ＬＤ₅₀)、半致矮剂量(ＧＤ₅₀)或临界剂量较为合适。

2.2 化学诱变

化学诱变育种是人工利用化学诱变剂诱发产生遗传变异，再通过多世代对突变体进行选择和鉴定、培育成具有较高观赏价值的新品种的技术。

狭意的化学诱变包括诱变材料的选择、诱变剂的选用，主要是通过化学试剂造成生物DNA的损伤和错误修复，产生突变体。这些突变以点突变为主，并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。广意上说，突变体筛选技术和随后的突变体分子检测技术的发展也是重要的组成部分，决定着化学诱变技术在当代科技的背景下，在育种上的广泛而有效的应用。

2.2.1 种类及方法

化学诱变剂大致包括碱基类似物、碱基修饰剂和嵌入染料3大类。烷化剂系列，如甲基磺酸乙酯(EMS)是专一作用于胞嘧啶的羟胺，它是目前运用最多、效率公认{zh0}的。此外，叠氮类化合物，如xxxx(NaN₃)和一些xxx也是良好的诱变剂。

在兰花化学诱变中应用较多的是秋水仙素诱导多倍体，应用EMS、NaN₃近年来才逐渐增加。秋水仙素诱导出的多倍体花卉新品种往往具有植株粗壮、叶大、花器官增大、花色更娇艳等特征，增加了花卉的观赏价值和商业价值。

秋水仙素诱变的常用方法^[8]如下：选择个体发育基本一致的原球茎，用不同浓度药剂处理。

(1)浸泡法。一是将原球茎浸于一定浓度梯度的秋水仙素溶液中，时间不等，然后接种于培养基上。二是置于一定浓度秋水仙素加二甲基亚砜溶液中处理。

(2)注射法。将一定剂量的秋水仙素溶液用微量注射器注入原球茎中。

(3)悬浮法。综合考察试验的难易度和材料的生长状况选定悬浮法进行处理，在三角瓶中加入不同浓度的秋水仙素溶液进行不同悬浮时间培养，条件是:pH6.0，温度25℃，摇床转速80r/min。

2.2.2 特点

其优点包括：易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高、专一性强、缩短育种年限等。

其缺点包括：（1）迟效作用和嵌合体问题，后代的鉴定与筛选较难。（2）化诱剂毒性较大，大部分能致癌，具有残留效应，必须考虑处理的安全性、诱变剂的稳定性及其不利代谢产物等。使用中必须十分谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触和吸入其蒸汽，即使已处理完的废液亦需妥善处理。

2.2.3 机理

主要包括碱基与突变、碱基类似物的诱变机制、化学物质诱变机制、嵌入机制等。

化学诱变效率得以提高的关键在于两方面:一是获取足够大的诱变群体;二是科学家的研究证实获得高于自然变异的突变率是可能的。突变来源于染色体畸变、DNA损伤、DNA复制错误和修复系统对错误的忽略。突破生物体的保护，造成DNA损伤并在复制中保存下来，使错误复制通过修复系统的作用稳定遗传给子代，这些环节的加深认识和技术突破使得诱变率提高成为可能。

3 组培诱变育种

组培与诱变结合育种方式以其独特的优势，受到广大育种工作者的青睐。

3.1 种类及方法

3.1.1 “组培＋辐射”方式

大致可以分为2大类^[3]。

{dy}类：先组培后辐射，即以组培养物为辐射材料。

基本技术路线：外植体——组培(二次组培)——辐射——继代——分化、生根——移栽。

第二类：先辐射后组培，即诱变处理植物的某一部分，再从辐射材料中直接或间接获得外植体离体培养。

基本技术路线：

其一：材料——辐射——取外植体(或外植体接种后马上辐射)——诱导——继代——分化、生根——移栽。

其二：材料——辐射——种植(当代或几代)——突变嵌合体或其他外植体——诱导——分化、生根——移栽。

相对来说这种处理方法辐射材料的种类要比{dy}类多。

3.1.2 “组培＋化诱”方式

多采用先组培后添加化学试剂，如秋水仙素进行诱变的方式。

3.1.3 “组培＋辐射＋化诱”方式

在组培的基础上，化学诱变与辐射复合处理时，即诱变材料先用γ射线、Ｘ射线、中子等辐射后再用化学诱变剂处理，辐射处理能改变了细胞膜的渗透性，促进处理材料对化学诱变剂的吸收，从而提高诱变效果。

3.2 特点

组培与诱变结合，一方面可以分离和显现细胞突变，快速繁殖纯和突变体;另一方面可以选择具有抗性的突变体，克服诱变育种的缺点。其优点如下^[3]：

（1) 离体组织对辐射的敏感性高，可提高突变频率，扩大变异幅度和变异范围，加速变异稳定，缩短育种周期。

（2) 有效地克服嵌合体和“二倍体选择”难题，提高突变细胞的显现率，减少嵌合突变体产生频率。

（3）诱变、选择、快繁同时进行，使诱变技术更为有效，有望育成异于诱变育种的新型种质资源。

（4) 在细胞水平抗性育种的定向选择，有助于实现单细胞的定向诱变。

3.3 应用

3.3.1 “组培＋辐射”方式

随着技术不断发展，在组培诱变机理、生理生化水平研究上已取得一些进展。有结果表明^[9—11]，一般情况下，低剂量辐射促进生长，高剂量抑制生长，且抑制作用与处理剂量间呈正相关关系（部分兰花组培辐射诱变育成状况及诱变剂量见表2）。

徐卫辉^[14]等研究证实，紫外光照射1小时利于兰花原球茎的增殖，照射0.5小时利于原球茎的分化。较高剂量的紫外光可导致细胞核的变形、皱缩、线粒体液泡化。在一定照射剂量条件下，紫外光照射可提高细胞无丝分裂频率。表明，紫外光照射引起的无丝分裂频率提高有利于兰花原球茎突变体的产生，有利于兰花品种的诱变。林芬等^[8]以春兰进行紫外光照射试验，也得到同样的结果。

傅雪琳^[9]等报道低剂量(2、5、8Ｇｙ)辐照使根状茎体内可溶性蛋白质含量增加明显，过氧化物酶(ＰＯＤ)活性的变化趋势不一，2和5Ｇｙ的低剂量辐照使根状茎ＰＯＤ活性稍有降低，8Ｇｙ的辐照使ＰＯＤ活性显著升高，说明一定水平的低剂量可诱导根状茎ＰＯＤ活性增强，从而增强抗辐照损伤的能力。强继业^[11]等实验证明了经10Ｇｙ辐射处理后蝴蝶兰有较高的光合作用和抗逆性。

3.3.2 “组培＋化诱”方式

组培化诱一般使兰花产生表型变异。林芬^[8]等以春兰的原球茎为材料，利用秋水仙素进行人工诱变处理，出现了植株变矮，叶片增宽、增厚等变异。张志胜等^［15］采用秋水仙素处理墨兰，处理浓度为０.１％、时间２４ｈ，变异率高，植株出现粗壮、多叶、叶片变厚、线艺或叶艺等变异。

使用秋水仙素，一般都能诱导出多倍体，但是诱导率不一。Ｋｉｍ等^[16]用0.01%和0.05%秋水仙素处理寒兰根状茎，在再生植株中，0.01%浓度处理2周、0.05%和0.1%浓度处理1周的多倍体诱导率分别为4.5%、5.2%、6.7%。

Hsien等^[17]用１２５nag/L秋水仙素处理五唇兰的原球茎，再生植株中有４６％为四倍体。

陈玉水^[18]介绍了台湾糖业研究所对不容易通过杂交而获得后代的三倍体纯黄色花系Phal. Golden Emperor “Sweet”经过10×10^-5的秋水仙碱处理叶片诱导出拟原球体，从中获得2个六倍体植株；中国台湾高雄大学生命科学系教授陈文辉成功将兰花染色体从“二倍体”提高到“四倍体”，让兰花花形大一倍，且味更香，色更艳，抗病性更强。

其他化学试剂也逐渐被应用到育种上来。陈超等^[19]用不同浓度的甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)和xxxx(ＮａＮ₃)对蝴蝶兰类原球茎球茎进行化学诱变试验，结果ＥＭＳ比ＮａＮ₃的诱变处理效果好，且创造蝴蝶兰ＰＬＢ突变体的参考浓度为0.5%。

3.3.3 “组培＋辐射＋化诱”方式

物理诱变结合化学诱变对兰科植物诱导突变体非常有效。目前诱变处理多以原球茎作为基础材料，也有以丛生芽、根状茎为材料，通过秋水仙素处理及⁶⁰Coγ辐射诱变，涉及兰属杂交种、五唇兰、寒兰、春兰、沉香虎头兰、蝴蝶兰、墨兰、墨兰与大花蕙兰F1杂交种、紫花苞舌兰^[20]。

4 问题与展望

4.1 问题

我国虽然在兰花诱变育种上取得了一定成绩，但整个研究发展水平仍然滞后于农作物诱变育种。主要表现在如下几方面^[21]：

（1）深入探讨诱变后兰花的形态解剖、生理生化、分子水平变化以及对损伤生理、诱变机理等研究不够。

（2）辐射诱变源与化学诱变剂种类单一。辐射仍然以Ｃｏ-γ射线为主，电子束、中子、紫外光应用较少。而对新的诱变手段，如低能重离子注入、激光等在兰花上应用尚未见报道。化学诱变在秋水仙素诱导多倍体方面取得较大的成绩，但其他的诱变剂还没有广泛应用。

（3）组培诱变育种与其它育种方法结合模式单一。在农作物上应用较多的“诱变+杂交选育”、“诱变+远缘杂交”、“诱变+杂种优势利用”等组合育种技术在兰花应用上较少见。

4.2 展望

针对兰花的组培诱变育种存在问题，本人认为应继续发挥其创新优势，并与现代育种新技术相结合，广泛深入地开展研究，使其在以下几方面具有更广阔的发展前景：

（1）新诱变源、化学诱变剂的开发和应用。

（2）利用现代技术有效的手段鉴定和选择优良突变体。

显微制片技术已被用于辐射损伤程度的分析。随着分子生物学的不断深入，ＤＮＡ分子标记也已应用于对目标性状或转移的目的基因的鉴定和筛选，同功酶技术与多种分子标记技术相结合，为突变体的检测提供了有利的工具，可显著提高观赏植物育种效率。虽然已有学者开始进行用同工酶谱技术、ＲＡＰＤ技术来区分真、假突变体，但没有提出针对育种目标切实可行的早期筛选突变体的方法。这个问题有待进一步研究。

（3）加快复合育种步伐。

加快与航天育种、杂交育种、远缘杂交育种、杂种优势利用、基因工程等多种方法相结合的步伐，培育出“新、奇、特”的兰花新品种，缩短育种、推广过程，使之获得更高的经济价值。

综上所述，组培诱变在兰花育种方面具有明显的优势，但也存在一些问题。研究中要充分利用其优势，采取措施克服不足，同时努力寻找新的更加有效而安全的途径和方法，特别是结合不同的复合处理技术，才能在兰花育种方面取得更多的进展，才能立足于竞争日益激烈的兰花业，走向世界。