细胞培养的无菌环境

一、无菌室
   无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。
   无菌室的xx和防污染：为保持无菌状态，经常xx是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2h），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2h）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行xx。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的xx方法。
   此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤xx；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。
二、超净工作台
   工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、xx甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。
    超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48m/s为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前{zh0}开启超净台内紫外灯照射10－30min，然后让超净台预工作10－15min，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。

常用培养器皿及清洗xx 

   细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、xx知识，学会清洗、xx方法是从事细胞培养工作必须的。
一、清洗   离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。
（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4个步骤。
1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。
2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。
3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用xx器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于6h，一般过夜或更长。放取器皿要小心。
4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，{zh1}用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。
（二）橡胶制品清洗
新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15min，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15min，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20min，50℃烤干备用。
（三）塑料制品的清洗
塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗3次，双蒸水泡24h，晾干备用。
（四）包装:对细胞培养用品进行xx前，要进行严密包装，以便于xx和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

二、xx和xx 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因
（一）物理xx法
1.紫外线紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，xx孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室xx，用法简单，效果好。
   紫外灯的xx效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2m的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3h，期间可间隔30min。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5m照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5m，照射时间30min为宜。
   紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。
2.高温湿热xx:压力蒸汽xx是最常用的高温湿热xx方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法xx。
   不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同xx物品所需的有效xx压力和时间不同。从压力蒸汽xx器中取出xx好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸煮沸消毒也是常用的湿热xx方法，它具有条件简单、使用方便等特点。
3.高温干热xx:干热xx主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120min，杀死xx和芽孢，达到xx目的。主要用于xx玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。
   干热xx后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。
   烧灼也是xx方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼xx。
4.过滤xx：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的xx等微生物颗粒阻留，从而达到xx目的。在体外培养时，过滤xx大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器xx。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
（二）化学xx：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡xx。
（三）xxxxx：xxx主要用于xx培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同xxx杀灭微生物不同，应根据需要选择。
    可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤xx系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段xx实验室空气；多用新洁而灭xx实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法xx培养用器皿；采用高压蒸汽xx或过滤xx方法xx培养液。