实验原理

Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

试剂和器材

一、试剂

Folin—酚试剂:

试剂甲：

1) 4%碳酸钠溶液

2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液

3) 1%硫酸铜溶液

4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，{yt}内有效。

试剂乙：

称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。

二、标准和待测蛋白质溶液

1. 标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释150倍。

三、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水

浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作：

绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

取2支试管，按下表平行操作：

三、计算

注意事项

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。

(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。

Folin-酚试剂法(Lowry法)测蛋白质含量

[原理]

    蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。