FR/CL体外干预人胃癌细胞株SGC-7901及人肺癌细胞株A549生长

赵婷¹  李苏宜^2*  崔玖洁¹  张华¹

             (¹ 东南大学临床医学院   ²东南大学附属中大医院肿瘤科南京 210009）

[摘要] 目的：体外环境下，研究金荞麦提取物FR联合刺梨提取物CL对人胃癌细胞株SGC-7901及人肺癌细胞株A549增殖及凋亡的影响。方法：MTT法检测FR、CL对SGC-7901、A549细胞的增殖抑制率；流式细胞术分析早期凋亡细胞比；RT-PCR、Western blot分析Ki-67及Bax、Bcl-2表达的变化。结果：FR、CL单药均可明显抑制SGC-7901、A549细胞生长，呈剂量依赖性；两药IC₃₀浓度联合呈协同效应； IC₃₀浓度FR、CL单药和1／2IC₃₀(FR)+1／2IC₃₀(CL)联合对SGC-7901细胞的抑制率分别为（33.89±0.22）%,（30.86±1.17）%和（44.25±0.50）%，对A549细胞的抑制率分别为（30.91±1.72）%,（29.07±1.41）%和（43.62±2.15）%。流式细胞术结果表明对照组、FR组、CL组、联合组细胞早期凋亡比率依次增加，两单药组及联合组与对照组之间、联合组分别与两单药组之间的差异均具相统计学意义(P＜0.05)，；与单药组比较,联合组Ki-67、 Bcl-2 mRNA/蛋白表达率有显著降低,而Bax mRNA/蛋白表达显著增高。结论：FR、CL均可抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞、人肺癌细胞株A549增殖，和诱导其凋亡，且联合应用存在协同效应。

[关键词] 金荞麦；FR；刺梨；CL；联合；SGC-7901；A549；凋亡

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金荞麦提取物FR、刺梨提取物CL分别对人肺癌细胞株、人胃癌细胞株的增殖及凋亡体外影响作用研究已有若干报道^[1][2]。为了探讨FR与CL联合应用对这两种肿瘤细胞生长的体外抑制作用，本研究选取人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC-7901，采用FR、CL的单药和联合干预的方式，系统观察体外环境下两种细胞的增殖及凋亡变化。

1  材料

1.1试剂

FR、CL均由贵州同济堂公司馈赠； RPMI1640培养基（美国Gibco 公司产品）；胎牛血清（天津灏洋公司）；四氮甲唑蓝(MTT)及二甲基亚砜（DMSO）(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)；逆转录试剂盒及PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司TaKaRa试剂盒)；鼠抗人Bax、Bcl-2、Ki67 单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；丙烯酰胺（上海生物工程公司）。

1.2细胞

人胃癌细胞SGC-7901及人肺癌细胞A549购自上海中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

1.3仪器

酶标仪（Model 550 美国Bio-Rad公司）流式细胞仪（FACS Vantage SE型，美国BD公司）

PCR扩增仪（5331德国Eppendorf公司）稳压稳流转移电泳仪（EPS604南京科宝仪器研究所）

2 方法

2.1细胞培养

含10％胎牛血清的RPMI1640培养液(内含0.1％青霉素、链霉素)，添加适量的HEPES、3%谷氨酰胺,pH 7.2-7.4，置37℃、5% CO₂ 培养箱内培养。

2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率

分别取处于对数生长期的SGC-7901细胞、A549细胞,0.25 %胰酶消化,制成5×10⁴个细胞／mL的悬液，空白对照组6孔，阴性对照组6孔及xx试验组(每种xx浓度6孔，重复3次)，每孔180μL，接种于96孔培养板内，置于37℃ ，5％CO₂培养箱中培养24h。将两种单药的六个不同浓度分别加在96孔板内，FR终浓度依次为7.5mg/L、15mg/L、30mg/L、60mg/L、120mg/L、240mg/L六种浓度，CL终浓度依次为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L六种浓度，每孔加药量20μL ；两药合用比例为1：1，每孔加药总量仍为20μL (每种单药剂量浓缩至1/2，各加10μL )；空白对照组以RPMI1640 培养液补足,每孔总体系200μL，两株细胞予同样的加xx式处理。培养48h后每孔加入20μL MTT 继续培养4h 弃上清后每孔加DMSO150μL置摇床低速混匀10min ，自动酶标读数仪比色波长570nm 测出光密度OD值并计算xx对肿瘤细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率计算公式:细胞增殖抑制率= (1 - 实验组OD 值均数/ 对照组OD 值均数) ×100 %。利用MTT法测定不同干预因素处理48h后的细胞增殖抑制率。

2.3 处理因素及实验分组

预实验分别得到单药CL处理/单药FR处理两种肿瘤细胞株各自的IC₃₀浓度。干预措施如下：

FR联合CL组：取1/2 IC₃₀浓度FR联合1/2 IC₃₀浓度CL

单药FR处理组：IC₃₀浓度单药FR

单药CL处理组：IC₃₀浓度单药CL

空白对照组

2.4 流式细胞术检测早期凋亡率

分别取对数生长期的两种细胞接种于50ml培养瓶中,每瓶细胞为2×10⁵个/mL，培养24h后弃去上清液增加不同的处理因素,再培养24h后消化收集细胞，检测细胞早期凋亡率。

2.5 RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA的表达

按以上实验分组处理细胞24h后, 按TRIZOL 试剂盒说明一步法提取总RNA, 紫外分光光度法测定RNA纯度和浓度。逆转录反应合成{dy}链cDNA, 进行PCR反应。

Bax上游序列: 5’-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3’

下游序列: 5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’；

Bcl-2上游序列: 5’-CTTCGCCGAGATGTCCAGC-3’,

下游序列: 5’-CCAGGAGAAATCAAACAGAGGC-3’；

Ki-67上游序列: 5’-GTGCTCTGGGTTACCTGGTC-3’,

下游序列: 5’-CAGGTGGAGTGTGCATTACC-3’；

β-actin上游序列：5’-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3’，

下游序列：5’-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3’。

PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳，BIO—RAD凝胶成像分析仪观察摄像。

2.6 Western blot检测bax、bcl-2、ki67的蛋白表达 

细胞处理同2.5，10000×g离心5min收集起来，加入Laemmli sample buffer(100μL/L 1×10⁶个细胞)裂解细胞。置热混匀仪上99℃加热8min，冰水浴冷却。然后4℃、10000×g离心10min。转移上清至另一无菌EP管内，取适量样品应用BCA试剂盒测量蛋白浓度。配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样前加入5%β-巯基乙醇，每个样品上样50μg蛋白。80V电压电泳2h，至溴酚蓝到达凝胶底部。转移蛋白至PVDF膜，80 V电压电泳2h。将膜置5％脱脂牛奶室温封闭l-2h，TBS+Tween洗膜3×5min。加入5％脱脂牛奶或5％BSA稀释的一抗封闭膜，置4℃摇床过夜。洗膜后再分别与相应的二抗（5%脱脂牛奶稀释）室温孵育1h，洗膜3次。将等体积混合的ECL化学发光底物A、B液均匀加在PVDF膜上，显色5min，X光片曝光3min后，将X片依次进行显影和定影。β-actin作为内参对照。

2.7 统计方法

实验均重复3 次,结果以均数±标准差表示。应用SPSS13.0统计xxxx进行t检验或方差分析, P < 0.05 被认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT法检测FR/CL单药对SGC-7901/A549细胞增殖率的影响

3.1.1FR/CL单药对SGC-7901细胞增值率的影响

一定浓度范围内FR/CL分别单独应用,随着xx浓度的增加,抑制SGC-7901增殖作用均逐渐增强，两药各自的各浓度组间比较均有显著性差异(均为P<0.05)，存在剂量-效应关系。见表1。

Table1 Inhibition effects of FR and(or)CL on the growth of SGC-7901 cell line( ±s,n=3)

3.1.2 FR/CL单药对A549细胞增值率的影响

一定浓度范围内FR/CL分别单独应用,随着xx浓度的增加,抑制A549增殖作用均逐渐增强，两药各自的各浓度组间比较均有显著性差异(均为P<0.05)，存在剂量-效应关系。见表2。

Table 2 Inhibition effects of FR and（or）CL on the growth of A549 cell line( ±s,n=3)

3.2 MTT法检测FR/CL联合对SGC-7901细胞/A549细胞增殖率的影响

3.2.1 FR/CL联合对SGC-7901细胞增殖率的影响

与对照组相比，FR组、CL组、联合组的SGC-7901增殖率均明显下降，差异均具有统计学差异(P＜0.05)；与FR组、CL组相比，联合组增殖率同样明显下降，具统计学差异(P＜0.05)，见表3。

Table 4 Growth of SGC-7901 cell line by different treatment ( ±s,n=3)

3.2.2 FR/CL联合对A549细胞增殖率的影响

与对照组相比，FR组、CL组、联合组的A549增殖率均明显下降，差异均具有统计学差异(P＜0.05)；与FR组、CL组相比，联合组增殖率同样明显下降，具统计学差异(P＜0.05)，见表3。

Table 4 Growth of  A549 cell line by different treatment ( ±s,n=3)

3.3 流式细胞术检测FR/CL联合对SGC-7901细胞、A549细胞早期凋亡的影响

3.3.1 FR/CL联合对SGC-7901细胞早期凋亡的影响。

如图 1所示，与对照组相比，FR组、CL组、联合组的SGC-7901细胞早期凋亡率均明显上升，差异均具有统计学差异(P＜0.05)；与FR组、CL组相比，联合组早期凋亡率同样明显上升，具统计学差异(P＜0.05)

Figure 1 Effects of FR、CL and the combination of FR and CL on cell apoptosis of SGC-7901 cells line

3.3.2 FR/CL联合对A549细胞早期凋亡的影响。

如图 2所示，与对照组相比，FR组、CL组、联合组的A549细胞早期凋亡率均明显上升，差异均具有统计学差异(P＜0.05)；与FR组、CL组相比，联合组早期凋亡率同样明显上升，具统计学差异(P＜0.05)

Figure 2  Effects of FR、CL and the combination of FR and CL on cell apoptosis of A549 cells

3.4 RT-PCR测定各干预因素致Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA变化

3.4.1 各干预因素致SGC-7901细胞Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA变化

如表5及图 3所示。与对照组相比，FR组、CL组、联合组的SGC-7901细胞Bax mRNA表达上调，Bcl-2和Ki-67 mRNA表达下调，Bcl-2/Bax值变小，显著性有差异(P<0.05)；分别与FR组、CL组相比，联合组Bax mRNA表达上调，Bcl-2和Ki-67 mRNA表达下调，Bcl-2/Bax值变小，同样有显著性差异(P<0.05)}。

Table 5 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA in SGC-7901 cell line by different treatment (x(—)±s,n=4)

Figure 3 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA in SGC-7901 cell line by different treatment    1:control group;2: FR group;3: CL group;4:FR+CL group

3.4.2 各干预因素致A549细胞Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA变化

如表6及图 4所示。与对照组相比，FR组、CL组、联合组的A549细胞Bax mRNA表达上调，Bcl-2和Ki-67 mRNA表达下调，Bcl-2/Bax值变小，显著性有差异(P<0.05)；分别与FR组、CL组相比，联合组Bax mRNA表达上调，Bcl-2和Ki-67 mRNA表达下调，Bcl-2/Bax值变小，同样有显著性差异(P<0.05)}。

Table 6 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 mRNA in A549 cell line by different treatment (x(—)±s,n=4)

Figure 4 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 、actin mRNA in A549 cell line by different treatment     1:control group;2: FR group;3: CL group;4:FR+CL group

3.6 Western blot 测定各干预因素致Bax、Bcl-2、Ki-67蛋白变化

3.6.1各干预因素致SGC-7901细胞Bax、Bcl-2、Ki-67 蛋白变化

如表7及图5所示。与对照组相比，FR组、CL组、联合组的SGC-7901细胞Bax蛋白表达上调，Bcl-2和Ki-67 蛋白表达下调，Bcl-2/Bax值变小，显著性有差异(P<0.05)；分别与FR组、CL组相比，联合组Bax 蛋白表达上调，Bcl-2和Ki-67 蛋白表达下调，Bcl-2/Bax值变小，同样有显著性差异(P<0.05)}。

Table 7 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 protein in SGC-7901 cell line by different treatment (x(—)±s,n=4)

Figure 5 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 protein in SGC-7901 cell line by different treatment

1:control group;2: FR group;3: CL group;4:FR+CL group

3.6.2各干预因素致A549细胞Bax、Bcl-2、Ki-67 蛋白变化

如表8及图6所示。与对照组相比，FR组、CL组、联合组的A549细胞Bax蛋白表达上调，Bcl-2和Ki-67 蛋白表达下调，Bcl-2/Bax值变小，显著性有差异(P<0.05)；分别与FR组、CL组相比，联合组Bax 蛋白表达上调，Bcl-2和Ki-67 蛋白表达下调，Bcl-2/Bax值变小，同样有显著性差异(P<0.05)}。

Table 8 expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 protein in A549 cell line by different treatment (x(—)±s,n=4)

Figure 6  expression_r_r_rs of Bax、Bcl-2、Ki-67 protein in A549 cell line by different treatment    1:control group;2: FR group;3: CL group;4:FR+CL group

4．讨论

    金荞麦属于双子叶蓼科药用植物，又名野荞麦、苦荞麦，是民间常用的xxx。最近研究证明金荞麦的有效成分是一类含素的缩合性单宁混合物，具有很高的xx活性。从金荞麦6个有效部位提取的单宁类化合物Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5和Fr6中，Fr4抗肿瘤作用最强^[3]。刺梨又称送春归、缫丝花，是一种蔷薇科蔷薇属多年生落叶丛生灌木，其有效成分中CL-1抗肿瘤作用最强^[4]。民间常将此两种xx联合应用xx恶性肿瘤，已有一系列实验研究证明了FR/CL单药对多种肿瘤细胞有抑制作用^{[5][6] [7][8]}。

课题组预实验发现：经FR、CL分别处理人胃癌细胞SGC-7901及人肺癌细胞A549后，显微镜下观察均可见高浓度组活细胞数明显少于低浓度组，且出现大量死亡细胞，FR组与CL组死亡形态不同。MTT结果证实：FR/CL单药对SGC-7901及A549均有明确的细胞抑制作用，且呈浓度依赖性，两药联合应用较单药应用两种肿瘤细胞增殖抑制作用均明显增强，提示两药之间存在协同作用。流式细胞术结果提示单药组、联合组两种肿瘤细胞株早期凋亡率明显高于空白对照组，并且联合组明显高于单药组，提示两药均可致两株细胞早期凋亡率提高，联合后存在协同作用。

RT-PCR/western blot结果显示，两株细胞Bcl-2 mRNA/蛋白、Ki67 mRNA/蛋白均高表达，Bax mRNA/蛋白低表达；xx处理后，与空白对照细胞相比，两肿瘤细胞株的CL单药组、FR单药组、联合组Bax  mRNA/蛋白表达水平均上调，Bcl-2、Ki67 mRNA/蛋白下调；分别与CL单药组、FR单药组相比，两株细胞的联合组Bax mRNA/蛋白上调幅度、和Bcl-2、Ki67 mRNA/蛋白下调幅度均明显增大，Bcl-2/Bax mRNA值较单药组明显降低，提示FR/CL对细胞增殖抑制作用增强是通过增加凋亡、减少增殖实现的。本研究不仅成功地重复了以往研究的结果^[5][6]，还首次发现了分别联合作用于SGC-7901、A549细胞时，FR与CL之间存在协同效应，并从多个角度反复证实了这一点。另外，我们在预实验中曾经用低剂量顺铂（10mg/L）作阳性对照，结果显示作用于肺癌细胞A549时联合组抑制率与顺铂相似。本研究从细胞，基因和蛋白三个层面，较为系统地探讨了CL与FR联合应用干预肺腺癌癌细胞株、胃癌细胞株的生长，为进一步的研究提供了线索。本研究仅在体外环境下进行了一些描述性探索，下一步的研究需要建立动物模型在体内环境中深入探索。

据实验结果认为：体外环境下，刺梨提取物CL、金荞麦提取物FR均具有显著抑制人胃癌细胞株SGC-7901及人肺癌细胞株A549增殖，促进其凋亡的作用，两药联合的作用效果更加显著。值得开展体内试验进行深入研究。

参考文献【略】