环孢素A致急性肾损伤及还原性谷胱甘肽的保护作用

张森¹　廖履坦²

　　已有研究表明，环孢素A(CsA)可以引起肾脏血流动力学改变，脂质过氧化损伤在介导CsA肾毒性方面起着重要作用。但是，肾血流动力学改变与脂质过氧化损伤间有无因果关系，目前尚不十分清楚。除肝肾毒性外，CsA对其它器官有无损害，报道甚少。临床上也未找到安全、高效的保护xx。我们通过观察CsA致急性肾损伤大鼠的内皮素(ET-1)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和Na⁺，K⁺-ATP酶等指标的变化及还原性谷胱甘肽(TAD)的作用，进一步探讨CsA肾毒性的发病机制，为临床防治CsA致急性肾损伤提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　实验动物　同龄雄性SD大鼠(体重250～270g)，随机分为3组。①对照组(Control)：食用色拉油0.7mL，每日8:00经口灌服1次，连续10d。②CsA组：CsA混合液0.7mL[(CsA剂量为50mg／(kg·d)]，给xx法同对照组。③TAD保护组(TAD组)：CsA给xx法同CsA组，同时给TAD注射液1.3mL腹腔注射[(TAD剂量为150mg／(kg·d)]，连续10d。

1.2　xx及试剂来源　①CsA口服液(油剂)：产自瑞士SANDOZ公司，使用时以1:4的比例用色拉油稀释，配成浓度为20mg CsA／mL的混合液。②TAD：由意大利福斯卡玛生化制药公司生产，使用时用生理盐水配成浓度为30mg／mL的混合液。③Na⁺，K⁺-ATP酶单克隆抗体：产自美国Amersham公司。④内皮素-1多克隆抗体：产自美国Peninsula laboratories，INC。⑤免疫组化ABC试剂盒：产自日本达科公司。⑥MDA测定试剂盒和SOD测定试剂盒：由南京建成生物工程研究所生产。其余试剂为国产分析纯试剂。

1.3　血肌酐、尿素氮测定　用beckman自动生化分析仪进行测定。

1.4　MDA和SOD的检测　取冷冻保存的肾组织加0.85％NaCl制成10％的组织匀浆，匀浆液离心15min(4000转／min)，然后按试剂盒说明书分别测定肾组织中MDA含量和SOD活性。

1.5　肾小管上皮细胞N⁺，K⁺-ATP酶活性和肾皮质内皮素-1水平的检测　①免疫组化染色：按ABC试剂盒说明书进行操作。②定量检测：用显微图像分析仪进行定量分析。

1.6　肾、肝、肺组织电镜检查　电镜切片由上海复旦大学医学院电镜室制作。

2　结　　果

2.1　CsA和TAD对肾功能的影响　实验前，对照组、CsA组和TAD保护组的BUN平均值分别为(3.00±0.24)mmol／L、(2.88±0.31)mmol／L和(2.80±0.18)mmol／L，各组的SCr平均值分别为(42.50±2.68)μmol／L、(41.97±3.66)μmol／L和(41.68±3.56)μmol／L。各组大鼠之间的BUN和SCr水平无差异。实验10d后，CsA组BUN和SCr明显增高[(8.42±2.15)mmol／L和(55.80±3.42)μmoL／L]，与对照组[(3.68±0.53)mmol／L和(43.13±5.08)μmol／L]相比有极显著差异(P＜0.001)，并明显高于TAD保护组[(4.77±1.46)mmol／L和(47.83±3.01)μmol／L，P＜0.01]，而TAD保护组与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。

2.2　肾组织中MDA和SOD的变化　CsA组肾组织MDA含量明显高于对照组(P＜0.001)，CsA组同时给予TAD，其MDA含量与对照组无显著差异(P＞0.05)，且明显低于CsA组(P＜0.001)。见表1。

　　CsA使大鼠肾组织中总SOD、铜锌SOD和锰SOD活力显著降低，与对照组比较差异极显著(P＜0.001)，给CsA同时给予TAD，其三种SOD活力均显著高于单纯用CsA组(P＜0.001)，其中总SOD和铜锌SOD的活力低于对照组(P＜0.05)，而锰SOD活力与对照组相近(P＞0.05)。见表2。

2.3　肾小管上皮细胞Na⁺，K⁺-ATP酶活性的变化　CsA可使肾小管阳性反应面积和平均光密度值显著降低(P＜0.01)，TAD能明显减轻这些变化(P＜0.001)。见表3。

2.4　肾皮质ET-1含量的变化　CsA使阳性区域面积增大，阳性区域平均光密度增加，提示阳性反应明显增强(P＜0.001)，而TAD使其阳性反应明显减弱(P＜0.001)。见表4。

2.5　大鼠肾、肺和肝组织形态学变化　在电镜下可见到，CsA组大鼠肾近端小管上皮细胞有空泡变性和微钙化，线粒体肿胀、结构模糊不清，刷状缘结构紊乱，微绒毛脱落等病理改变。TAD组大鼠肾近端小管空泡变性较少，线粒体和刷状缘结构近似正常肾，微绒毛脱落较少；CsA组大鼠肺Ⅰ型上皮细胞可见空泡变性，包涵体形成等病理改变，TAD组大鼠肺Ⅰ型上皮细胞偶见空泡变性；CsA组大鼠肝组织结构紊乱，可见空泡变性，线粒体结构紊乱，TAD组大鼠肝组织偶见空泡变性，近似对照组。

3　讨　　论

3.1　CsA可产生血管收缩作用，尤以肾小球入球小动脉收缩明显，导致肾血流量和GFR下降，血肌酐和尿素氮升高，提示肾血流动力学改变，在CsA诱发的急性肾损伤中起着重要作用。内皮素(ET)是一种主要由血管内皮合成和分泌的强力缩血管肽，具有很强的血管收缩作用，能引起肾血管阻力增加，肾血流量下降，降低肾小球滤过率。CsA影响ET释放的机制可能是CsA损伤内皮细胞所致。本实验发现，CsA处理后大鼠肾皮质ET-1含量显著增高，尤以肾小球及周围血管处增高最为明显，相应的BUN和SCr值也大大高于对照组，提示ET-1在介导肾血流动力学改变，最终导致CsA中毒性急性肾损伤方面可能起着重要的作用。

3.2　哺乳类动物细胞含有两种SOD，即胞浆中的铜锌SOD和线粒体中的锰SOD。SOD可以歧化O2生成H2O2，保护细胞不受强毒性氧自由基的攻击。本实验发现，CsA中毒性急性肾损伤时，大鼠肾组织中总SOD、铜锌SOD和锰SOD活力均降低，MDA含量较对照组高，提示胞浆和线粒体对氧自由基的xx能力下降，CsA造成的氧自由基增多，致肾组织脂质过氧化损伤参与了CsA的肾毒性。生物膜的多不饱合脂肪酸含量较多，对氧自由基的过氧化损伤作用非常敏感，而CsA的疏水特性，决定了其对脂肪和脂蛋白的高亲合性，这是CsA致肾组织脂质过氧化损伤的一个重要原因。本实验中锰SOD活力的降低及电镜下发现肾小管上皮细胞内线粒体结构的破坏，均提示氧自由基对线粒体膜的结构和功能的损伤，这也是肾组织脂质过氧化损伤进行性加重的重要因素。

3.3　Na⁺，K⁺-ATP酶是一种跨膜疏水蛋白质，可将K⁺从细胞内泵出细胞外，将K⁺从细胞外泵入细胞内，其活性依靠脂质尤其是磷脂的存在，若该酶去脂时，其活性丧失且无法逆转。MDA可通过其醛基作用于细胞膜磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的氨基形成新的磷脂，从而影响泵功能。MDA还与蛋白质交联，使膜蛋白变性，影响Na⁺，K⁺-ATP酶活性。CsA可直接与Na-D葡萄糖共同转运系统发生作用，减少Na⁺，K⁺-ATP酶α1，亚单位mRNA的数量，改变其表达，使其活性降低。本实验发现，MDA含量增高，肾小管上皮细胞Na⁺，K⁺-ATP酶活性降低，提示细胞膜受脂质过氧化损伤，钠泵功能受损，导致细胞内钠潴留，Na⁺-Ca⁺²交换增加，细胞内钙负荷增加，最终形成磷酸盐沉积于线粒体，使其结构和功能受损，加重肾组织脂质过氧化损伤，肾小管上皮细胞坏死。因而，Na⁺，K⁺-ATP酶活性降低，在介导CsA致急性肾损伤中可能也起着重要作用。

3.4　TAD是非蛋白类巯基化合物，可以和自由基反应。从而减少体内的过氧化物，保护细胞蛋白和细胞膜免受自由基损害，在细胞抗过氧化物损伤方面有重要作用。本实验用TAD保护后，能显著降低肾组织中MDA的含量，肾皮质ET-1水平也显著降低，肾小管上皮细胞Na⁺，K⁺-ATP酶活性正常，SOD活力也有不同程度的恢复，锰SOD活力与对照组相近。提示TAD通过xx自由基，减轻脂质过氧化损伤，保护Na⁺，K⁺-ATP酶活性，保护细胞膜和线粒体膜及其它生物膜，从而使ET-1释放减少，SOD活力得以部分恢复，尤以锰SOD活力恢复更佳。ET-1水平升高使血管收缩和肾血流量减少，但在CsA致急性肾损伤时，ET-1水平升高与过氧化损伤间谁为因果，目前作者尚未见报道。本实验发现，用TAD后随着MDA水平的降低，ET-1水平也降低，提示由于TAD对自由基的xx，保护了细胞膜，因而使ET释放减少。所以，我们认为CsA可造成氧自由基产生增多，导致脂质过氧化损伤，加重细胞膜的破坏，增加ET的释放，导致肾血流动力学改变，使肾血流量减少，造成类似缺血性肾损伤，从而使氧自由基产生增多，这两个因素相互作用，使肾损伤进一步加重，而脂质过氧化损伤在CsA诱发的急性肾损伤中可能起着更为重要的作用。

3.5　电镜下发现，CsA除可造成肾小管上皮细胞内发生空泡变性和微钙化、线粒体肿胀、结构模糊不清、刷状缘结构紊乱、微绒毛脱落外，还可见到CsA致肝、肺组织的空泡变性和结构破坏，TAD能使这些病变明显减轻，提示TAD对组织的结构和功能均有有效的保护作用。

作者单位：1.哈尔滨医科大学第二临床医学院肾内科，黑龙江 哈尔滨 150086；2.上海复旦大学医学院中山医院肾内科

来源：《中国急救医学》第23卷第8期