今天是我正式开始实验的第1日。做c-cbl抗体的预实验，摸索最适浓度。试剂是1月21日到的。 早上去看到给我准备的6张切片放在烤箱旁边的桌子上，摸了摸是凉的，猜想肯定没有拷片过夜，但仍怀着一丝希望问了一下W老师。W老师说昨天烤了一个半小时，今天早上至少也得再烤一个半小时。其实忘了就是忘了，今天再烤也一样，把对方当成傻瓜说谎就不太好了。 片子烤了一个小时Z老师就让我拿出来了，她说要是脱片怎么烤也会脱，好片子不烤也没关系。所以我进行了我该操作的第1步： 1.脱蜡至水：经过二甲苯和梯度酒精后，放到自来水中冲了月4分钟。 2.抗原修复：因为说明书上没有写是否需要抗原修复，我把病理号B09066-2的片子分成两组，每组三张。一组做酸修复，另一组不做修复。原想也做一组碱修复的，但可能需要多切许多片子，用很多抗体，我实在没有钱，所以就放弃了，文献上说，大多数抗原是适合酸修复的，尤其是放置比较久的蜡块。希望我是幸运的。高压修复完毕。 3.去除过氧化氢酶：高压锅煮完冷却后，滴加过氧化氢，室温孵育10分钟。 4.羊血清封闭：这一步我犯了一个错误，幸亏Z老师提醒。有一张片子我没用PBS洗就加了羊血清。封闭10分钟。 5.梯度稀释抗体：在封闭的这10分钟内，做了很多事。从-20℃的冰箱里拿出我珍贵的只有0.2ml的抗体，离心了一会儿。抗体反复的冻融最易导致效价下降，所以做抗体分装，平均分成4个50微升，装到EP管里。浓度按1：50，1：100，1：200分组，每组两张。先取PBS 98微升至管1，再去PBS 198微升至管2。将管1加入2微升抗体，配成浓度1：50。将管2加入2微升抗体，配成浓度1：100。 6.加一抗：弃去羊血清，不洗。先加1：50的两张片子，每张50微升，过程顺利，管1液体用完。再加1：100的片子，过程顺利，管2余100微升液体。再向管2加入100微升PBS配成浓度1：200，再加1：200的片子，顺利！ 7.4℃过夜。 今天做到这里，明天加二抗、显色、分片。希望是张阳性的染色，就让我摸索一次浓度就行了。双手合十。 总结一下：@不要自以为是：我以为我等了这么多天，这6张片子能事先在烤箱过夜呢；我以为今天能再给我切几张，明天做her-2.....我忍了。 @计划总不如变化快。但还是要计划。 希望一下：@努力想着那个期望定律，我希望的事就会发生。 |
