张欣欣  韩悦    上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科
 
     目前，全球慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者多达3.6亿，我国占1.2亿。而丙型肝炎病毒（HCV）的全球感染人数也达到1.7亿，中国地区丙型肝炎病毒感染率大约3.2%。慢性感染者中约50%～75%有活跃的病毒复制和肝脏炎症改变，部分慢性肝炎可进展为肝硬化、肝衰竭或原发性肝癌，是主要的疾病死亡因素之一。慢性肝炎的理想xx终点是彻底xx肝炎病毒，但目前的抗病毒xxxx在大多数还无法实现这一点。

    慢性乙肝的临床xx目标，主要包括ALT转归正常、HBV DNA复制抑制以及HBeAg血清学转换，其中，抑制HBV DNA复制是最基本的目标。HBV DNA的定量检测对于诊治慢性乙型肝炎以及临床新抗病毒xx的研发起着非常关键的作用。三大主要肝病协会——美国肝病研究协会(AASLD)、欧洲肝病研究协会 (EASL)、亚太肝病研究协会(APASL)都在指南中强调了病毒载量的重要性。APASL指南指出：“持续抑制HBV病毒复制，对于减少或者预防肝脏损伤和疾病发展至关重要”。在慢性乙肝xx流程图中明确提出：“慢性乙肝xx的目标就是xx或者{zd0}限度地抑制HBV DNA复制，并防止疾病进一步发展”。同时，虽然对于检测间隔时间各协会之间还存在着差异，但各大指南也都认为病毒载量是监测疗效的重要依据。抗病毒xx过程中，HBV DNA载量的上升提示潜在耐药株的产生。 HBV DNA定量已成为慢性乙型肝炎的基本诊疗依据。

    同样在丙型肝炎诊疗中， 定期检测HCV RNA有助于预测持续病毒应答，指导制定后续xx方案，起到疗效预测作用，帮助患者树立信心。xx4周和12周HCV RNA结果能够辅助预测xx失败。所以， HCV 病毒载量的监测在丙肝感染及xx过程中的意义也是举足轻重。

    随着现代诊疗日新月异的进步，临床对于HBV DNA/ HCV RNA病毒载量检测技术的要求越来越高，不仅需要检测结果精准，且必须具备{jj0}的灵敏度，检测限能够达到WHO标准（HBV DNA 12 IU/ML，HCV RNA 15 IU/ML），并能够覆盖不同基因型和亚型的检测，从而满足慢性肝炎诊断、xx监测和预后评估的全方位需求。

    回顾慢性肝炎的实验室评估指标，国内从早期的肝功能检测，血清学定性试验，DNA杂交，到最近实时荧光定量PCR技术在临床实验室的普及，随着分子技术的发展，使得病毒核酸检测的敏感度大大提高，促进了血清病毒载量和疾病发展相关性的研究。病毒核酸检测方法可以分为信号放大定量、靶基因扩增定量等二大类，其中实时荧光定量PCR技术已在临床上广泛应用。

    1.信号放大定量检测

    信号放大定量分析的原理是将特定核酸序列信号增强，而不是直接扩增受检核酸的量。一般来说，信号放大方法虽然比其它PCR原理的检测手段有许多优点，但其敏感度要低于目标片段扩增定量分析方法。作为最早广泛应用的HBV DNA定量检测手段之一，Digene杂交捕捉系统结合了杂交法和酶免疫法的优点。其第二代杂交捕捉系统的检测范围为0.5~6000pg/ml（即1.4×105拷贝/ml到1.7×109拷贝/ml）。近期开发的Versant? HBV DNA3.0 （bDNA）也是一种基于一系列连续DNA杂交的信号放大定量检测法。样本最终产生的化学发光信号与其HBV DNA量成比例，计算机通过比对样本信号值和标准品产生的信号曲线，从而计算出实际样本HBV载量。这一技术的灵敏度约为2×103拷贝/ml~1×108拷贝/ml(3.5×102IU/ml ~1.8×107IU/ml)。

    2.靶基因扩增定量检测

    实时荧光定量PCR技术是指通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。这一技术的应用明显提高了定量分析的测量范围。而且，此方法省却了烦琐的PCR后步骤，也由此避免了扩增产物之间的相互污染。

    实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

    最早的商业化PCR检测HBV DNA方法是瑞士罗氏诊断公司研发的AMPLICOR HBV MONITOR?。目前，罗氏开发的COBAS Ampliprep & COBAS Taqman 48全自动实时荧光定量PCR系统，被行业誉为“国际分子诊断金标准”检测平台。其中COBAS Ampliprep是一款基于磁珠分离技术的全自动核酸分离纯化系统，使用磁珠分离技术从样本中分离纯化RNA或DNA，确保了高质量的核酸分离纯化。COBAS Taqman 48分析仪是一款基于TaqMan探针的实时定量PCR检测技术的PCR仪，可为实验室提供更广泛的动力学范围、更高的灵敏度和特异性。 在实时荧光定量PCR技术的实际应用中，标准品的选择及参与反应的方式、时间都至关重要。COBAS Ampliprep/ COBAS Taqman系统拥有目前{wy}获得SFDA批准上市的进口HBV/HCV荧光定量PCR测试试剂。该试剂使用了内标法进行定量，内标是已知拷贝数的人工构建的核酸，加入每一个反应管，与靶核酸竞争扩增。可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性，同时补偿反应效率的差异，得到可靠xx的结果。此方法的检测范围下限在30IU／ml，上限大于1.1×108 IU／ml（采用高质量核酸抽提方法时检测范围可以达到1.7×102 IU／ml 到 8.5×108 IU／ml）。

    3.国际标准化