扩增基础上的已知点突变检测进展

杨卫华

上海第二医科大学  上海市医学检验重点实验室

摘要：在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。本文着重介绍了几种近年发展起来的新技术：反向限制性位点突变分析(iRSM)、荧光PCR（SYBR Green I结合熔解曲线分析技术、荧光共振能量转移(FRET)结合探针熔解曲线分析技术）、基因芯片、等位基因特异性扩增技术(ASPCR)。

关键词：聚合酶链式反应  点突变   Tm值  荧光  基因芯片  等位基因

随着人类基因图谱草图的公布和各种病原体基因序列的揭示，这都将极大的促进疾病相关基因的结构和功能研究，特别是基因缺失、错位、突变（有义突变）等与疾病的关系。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例^[1]，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶DNA（目的DNA）含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。在过去十多年中，曾出现了诸如经典的PCR-RFLP、ASO以及OLA、COP、PEX等点突变的检测方法，本文将对近年来发展起来的对已知点突变分析方法进行综述。

⒈ 反向限制性位点突变分析（inverse restriction site mutation , iRSM）

1978年Kan和 Dozy创立的限制性片断长度多态性（restriction fragment length

polymorphism , RFLP)连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了^[2]。

为了能够提高RFLP分析技术的敏感性，1999年Jekins等人对其进行了改良，创立了一种名为反向限制性位点突变分析（iRSM）^[2]，进行低突变频率等位基因的检测。其方法（如图-1所示）主要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点（E₁位点）的消失，产生一新的酶切位点（E₂位点），称之为E₁→E₂突变，但突变频率较低常规RFLP无法检测。此时，用一内切酶(E₁)对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列（>99%）。无酶切位点的部分通过PCR扩增（引物被设计在E₂位点的一侧），产物用另一内切酶（E₂）进行RFLP分析，根据产物中是否存在E₂位点即可判断有无突变发生。

由于该方法在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量（一般消化率>99%），因而大大提高了突变序列的检出率。值得注意的是：只要选择适当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。这可以通过使用高保真聚合酶进行修正；同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量^[2]。

⒉ 荧光PCR检测点突变

自RFLP{dy}次进行点突变检测以来，此后的20余年中诞生了不下20余种检测法，近年来随着自动化荧光检测技术的建立，其取代凝胶及放射性标记分析产物的趋势已经形成^[4]。这就意味着以荧光为标记物的检测技术在不远的将来可能在突变检测中占有重要的一席之地。

2.1 SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变

SYBY Green I是一种双链特异性的DNA染料，只与双链DNA结合，并且单个存在时并不发射荧光，只有当多个SYBY Green I嵌入双链时才能被检测到。当此双链通过变性温度时产生的荧光会快速衰减而形成特异的熔解曲线，如果在PCR扩增循环过程中对SYBY Green I发出的荧光进行持续监测，那么利用这一特征可对不同产物的变性进行观测^[5]。产物的熔解曲线取决于GC含量、序列长度以及碱基序列。如果扩增产物中存在突变型序列，那么在变性过程中它与野生型序列之间解链温度即Tm就会产生差异。Tm相差2℃以上，就可通过它们各自的熔解曲线将其分离^[6]。

这种点突变分析技术的特点是简单、快速、自动化程度较高，易于推广；但是所用的染料SYBY Green I与溴乙啶^[7]、YO-PRO-1^[8]一样，缺乏序列特异性，因此不可避免的将会降低其敏感性。在扩增过程中产生的非特异性荧光，通常是由引物二聚体和其它污染物的扩增产物引起的，单以荧光很难将其与靶序列发出的荧光相区分。另外扩增产物碱基序列数较大时，单个碱基置换引起的点突变其Tm变化较小，运用SYBR Green I和熔解曲线分析就很难检出^[6]。

2．2 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer , FRET）结合探针熔解曲线分析点突变

经典的ASO突变检测技术是利用探针与不同扩增产物之间杂交稳定性的差异来检测点突变。而FRET结合探针熔解曲线分析法（以下简称FRET法）正是通过对杂交产物稳定性进行实时监测，并结合熔解曲线分析，提高了对点突变检测的分辨率^[9]。

Bernard等人针对点突变序列区域设计探针，并在其5´端标记荧光，同时在PCR引物的3ˊ端附近标记Cy5，那么经PCR扩增后就会得到若干条标记有Cy5的扩增产物。当标有荧光的探针与这些产物相互补后就会产生FRET。在PCR扩增过程中伴随温度升高，对其产生的荧光进行实时监测即可得到特征性的探针熔解曲线，通过曲线分析即可检出产物中是否存在突变^[3]。

FRET法主要依据野生型和突变型序列在变性温度下的杂交不稳定性差异进行点突变检测。目前认为：这种杂交不稳定性主要取决于探针的长度，错配的特异性，错配所处的位置以及与其邻近的碱基对^[3]。研究表明：短核苷酸序列的不稳定性明显大于长核苷酸序列；在所有的碱基对中G:T错配相对较稳定；邻近的碱基对是G:C的要比是A:T的更稳定^[9]；错配碱基离寡核苷酸中心越近与xx匹配的碱基Tm相差越大，即不稳定性越高^[10]。

为了研究FRET法的敏感性，1997年Bernard等人用此法对甲基四氢叶酸还原酶的C677T点突变进行了检测。他们所选择的PCR扩增产物序列长度为198bp；突变类型为C→T的置换，构成了G:T错配；突变点邻近的碱基对是G:C；探针长度为26bp，错配位置距3′荧光标记物仅5bp的距离。尽管检测条件不太理想，但还是检出了点突变。这充分表明，FRET适用于任何形式的点突变的检测^[3]。

上述的SYBR Green I法和FRET法对点突变的检测均依赖于熔解曲线分析，但存在着诸多限制条件，即：①熔解曲线的相对位置和宽度与所加入的染料浓度及温度转换率相关。据有关资料显示：染料浓度增加会导致熔解温度升高、熔解转换变宽^[10]。②PCR扩增的平稳熔解曲线的温度转换率一般是0.5℃∕min^[11]，有人认为0.2℃∕s更适宜产物的分离。较为理想的解决方案是：适当降低转换率和/或使样品受热更均匀。此外，如结合熔解峰分析就更能提高突变点的检出率^[6]。

⒊ 基因芯片(gene chip)

基因芯片技术系指：将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。它是基于特异性探针与目的DNA杂交的原理发展起来的一种分析方法，可用于大规模检测基因突变、基因多态、基因表达水平以及测定DNA序列^[12，13]。

基因芯片检测突变的原理是^[14]：将许多已知序列的核苷酸DNA被排列在一块集成电路板上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖整个所需检测的基因，通过RT-PCR扩增

得到的正常cDNA和突变cDNA分别用荧光标记，并与两块DNA芯片杂交，由于至少一个碱基的差异，正常cDNA和突变cDNA将会得到不同的杂交图谱，通过共聚焦显微镜分别检测两种cDNA分子产生的荧光信号即可确定是否存在突变。探针与样品xx匹配所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5~35倍，所以对荧光信号强度xx测定是实现检测特异性的基础^[15]。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度也证明可以检测基因^[16]（ras等）的单碱基突变。

该方法具有检测信息高通量和自动化程度高，一次性检测可检出多个位点突变，具有很大的发展潜力。1996年7月，{dy}块有关HIV酶的DNA芯片问世，相信随着技术的进一步改进，该方法在突变检测中将会发挥越来越重要的作用^[17]。

⒋ 等位基因特异性扩增技术（allele-specific PCR或 amplification , ASPCR或ASA）

ASPCR是一项在PCR基础上发展起来的新方法，通过PCR和凝胶电泳即可检测出DNA中各种点突变。

ASPCR的基本构思是设计2个ASO引物，使之与另一引物构成PCR反应体系。这2个引物与探针的ASO不同，等位基因特异性碱基不是位于ASO中间，而是置于引物的3′端。这种设计是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5´外切校正活性的特点。引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′,5´-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系（amplification refractory mutation system , ARMS）。其扩增结果为：“野生”模板阻碍,“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍,“野生”引物放大。

ASPCR点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配时可能发生的错配延伸，这可通过调整实验条件如：引物、靶DNA、Taq酶的浓度和反应温度等来提高特异性，在反应体系中加入甲酰胺亦可减少非特异性扩增。还可通过人为地使引物3′末端的第二个碱基发生错配来阻止错误延伸。

近来又有报道：在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，通过对产物荧光分析即可了解到模板中是否存在点突变，此法称为双荧光扩增受阻突变系统（double fluorescent-amplification refractory mutation system, dF­ARMS）^[18]。

⒌ PCR-ELISA结合微测序检测点突变（PCR-ELISA & mini-sequencing）

新近有报道称：使用PCR-ELISA结合微测序检测到无临床症状且未经抗病毒xxxx的乙肝患者HBV基因的YMDD主题突变区存在xxLamivudine耐药基因 ^[19] 。其检测原理如下：探针结合区野生型HBV基因序列：5´-…⁷³⁹ATA CGG⁷⁴⁴ A…-3′, 针对突变区域设计的探针，Wild-Probe: 5´-…ATA CGG-3′；Val-Probe: 5´- …ATG TIG-（针对741～742位点突变，743位点设计摆动配对）；Ile-Probe: 5´-…ATA TAG-3′、5´-…ATA TCG-3′、5´-…ATATCG-3′（针对743位点突变）。变性的扩增产物与上述3种类型探针杂交后，再加入含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg²⁺等的微测序缓冲液55℃温育。如果Val或Ile探针与靶DNAxx匹配，探针3′末端延伸一个带标记的腺嘌呤。反之，不匹配时，探针Tm降低，3′末端游离而不延伸标记的腺嘌呤。利用链酶亲和素酶标系统检测探针上标记的生物素，可判断样品中是否存在点突变。

而近期我们所进行的点突变检测是基于PCR-ELISA和杂交链稳定性的基础上发展起来的，主要是利用野生型和突变型序列与探针结合后在Tm值上的差异进行检测。

近年来随着新技术、新材料的不断涌现，已知基因单位点突变检测技术将会得到迅速的发展，从而距离理想的突变扫描方法（即：对大片段DNA进行突变扫描，{bfb}的检出率，无假阳性或假阴性现象，不需复杂的设备、花费低、不需使用有害试剂和同位素、高效率、耗时短。）越来越近。