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【关键词】 免疫ELISA方法 试验效果
ELISA试验以灵敏度较高，特异性较好的特点在临床广泛应用。但操作中的每个环节对试验的检测结果影响较大，如不按常规操作，可以导致显色不符，花板等情况。下面将操作中每个环节常出现问题的原因及解决方法总结如下，以提高检验质量，减少试验误差，更好地为临床服务。
在试验工作中，首先试剂要优良。我们实验室测乙肝两对半及丙肝抗体用的是厦门新创的试剂，必须严格按照操作步骤进行操作，同时做好室内质控、室间质评，以严格的工作作风检验每一份标本，才能保证检测质量。全自动酶标仪的应用，对于实现ELISA标准化检测，提高检测质量起到了重要作用。
方 法
选择试剂：要选择试剂质量优良的检测试剂，严格按照说明书进行操作，操作前将试剂从冰箱冷藏格取出，在室温下平衡30～60分钟。
加样：标本为血清时，{zh0}待血清在乳胶管中5分钟彻底凝固后，再用4000转/分离心5分钟，使血清和血球、纤维蛋白xx被凝胶分开；若标本为血浆，必须使用含抗凝剂血液标本收集管，采血后必须立即颠倒混合5～10次，放置一段时间后，用3000转/分钟，离心15分钟。若需在几天内检测，可放在2～8℃冰箱中，若要久置贮存，则置于-20℃的低温冰箱内（加样后及时放入37℃水浴箱，加酶结合物后用吸水纸在加样板表面轻拭吸干，标本较多时，分批加样测定）。如果血清或血浆标本分离不好即进行加样，加入的血清易出现凝固，影响阴阳性检测；手工操作中，加样板过多造成加样后放入37℃水浴箱前等待时间过长（特别是室温较高时）；另外加完样本再加酶结合物时，酶试剂溅出孔外等，均影响结果。
孵育：孵育时加样版贴封片，按说明书步骤严格控制操作时间；若孵育时未贴封片，使标本稀释液蒸发，吸附于孔壁，容易清理不彻底；孵育时间人为延长，导致非特异性结合，紧附于反应孔周围，不易清洗，影响结果。
洗板：保证洗液注满各孔，洗板机畅通，洗完板后，{zh0}在吸水纸上轻轻拍干（选择干净，无或少尘的吸水材料）；合理安排，尽量缩短洗板时间。若采用手工洗板，孔与孔之间液体交叉；采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不xx，洗板不畅，导致洗板效果差，均影响试验结果。
显色：显色剂尽量临用前配制，不用过期的显色剂，肉眼可见浅蓝色的显色剂不能用；加样时保持显色剂不外流，A、B液应避免接触金属器械；若显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂，加显色剂时溅出孔外造成液体回流，均影响试验结果。
终止液：加终止液时应避免产生气泡，若加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。
读板：读板时应保证酶标板清洁，若酶标板板底不清洁，影响试验结果判定。
若整套试验严格按上述操作，还需在整个操作过程中保证酶样板和测试试剂均不能接触次氯酸，实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。
讨 论
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自20世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
原理：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体-聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，
依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
注意事项：①正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 ②在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求pH在9.0～9.6。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值{zd0}而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部分)。然后再固定其他条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10～30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制。
