【摘要】 目的：建立中药“辨证毒理”假说。以附子为例，研究不同证候应用附子后产生的毒性差异。方法:丙基硫氧嘧啶100 mg·kg-1·d-1造成阳虚模型,甲状腺素片悬混液150 mg·kg-1·d-1复制阴虚模型，同时给附子水煎剂，附子高剂量组为8 g·kg-1·d-1，附子低剂量组为4 g·kg-1·d-1，空白组使用相同剂量的生理盐水。结果：28 d后大鼠股动脉放血处死，取大鼠血清，测各组大鼠血清中乌头碱含量。测试结果显示，各组大鼠血清中乌头碱含量有差异存在。结论：实验结果表明附子对阴虚、阳虚大鼠的毒性存在差异，从而说明中药辨证毒理假说的客观性。

【关键词】 附子 毒性 附子 分离和提纯 乌头碱

    基金项目:国家中医药管理局课题（课题编号：02-03zp16）        经过大量的古今文献研究可以看出，中药在辨证正确的前提下可以减少甚至xx其毒副作用。为了验证中药辨证毒理这一假说，以附子为例进行验证。双酯型生物碱是附子的重要成分，主要包括乌头碱（Aconitine，AC），中乌头碱（Meaconitine，MA），次乌头碱（Hypaconitine，HA）。这３种乌头碱是附子毒性作用的主要成分，附子水煎后双酯型生物碱水解成单酯型生物碱，毒性明显降低而中毒的性质相似，再进一步水解为相应的醇胺乌头碱、中乌头碱和次乌头碱，毒性降低更明显，且作用性质也与母体化合物不同。在附子水煎液中次乌头碱的溶出量{zg}，由此推测，附子煎煮溶液中主要毒性成分可能是次乌头碱，其他乌头碱也有煎出，因此测试血清中乌头碱含量可以显示附子对机体毒性作用的大小［1］。

    1 实验材料

    Wistar大鼠90只，SPF级，丙基硫氧嘧啶片（德国瑞姆斯制药股份公司赫尔布兰德分部生产，50 mg/片，进口药品注册号：H20060262），甲状腺素片（天津君安生物制药有限公司生产，批准文号：国药准字H12020111），炙黑附子（购自天津市中药饮片厂，产自陕西，批号：03090418B），乌头碱标准品（新乌头碱，原乌头碱，次乌头碱，由天津北联精细化学品公司提供批号2007-09-30），1100型液相色谱仪。

    2 实验方法

    2.1 动物分组及给药 大鼠分为9组,分别为空白组、空白附子高剂量组、空白附子低剂量组、阳虚模型组、阴虚模型组、阳虚附子高剂量组、阳虚附子低剂量组、阴虚附子高剂量组、阴虚附子低剂量组，每组10只。阳虚模型给甲状腺抑制剂丙基硫氧嘧啶100 mg·kg-1·d-1［4-5］，配制成5 mg/mL的悬混液灌胃。每日上午9时灌胃（阳虚模型组、阳虚附子高剂量组、阳虚附子低剂量组）持续28 d。阴虚模型给甲状腺素片150 mg·kg-1·d-1,配制成10 mg/mL悬混液灌胃［6］。每日上午9时灌胃（阴虚模型组、阴虚高剂量组、阴虚低剂量组）持续28 d。盐附子按2000版药典方法鉴定。等效剂量为成人用药量的6倍，按成人用量10 g·d-1计。等效剂量按照体表面极换算为1 g·kg-1·d-1灌胃。附子高剂量组为8倍等效剂量，低剂量组为4倍等效剂量。水煎60 min制成1 g生药/mL药液备用。空白组等量生理盐水灌胃每天下午4时1次。

    2.2 实验方法 实验开始后每日上午9时给造模药，下午4时给附子水煎剂。空白组给相同剂量的生理盐水。晚9时观察大鼠一般状态1次。实验周期4周，每周测1次体重,前3周每周测1次肛温。第28 d时股动脉放血处死，将大鼠4℃全血低温离心，3500 r/min，15 min,取各组大鼠血清置于炮弹管内于-20℃冰箱待测。

    2.2.1 检测样本 乌头碱标准品（新乌头碱，原乌头碱，次乌头碱，由天津北联精细化学品公司提供，批号：2007-09-30），炙附子提取液（天津市中药饮片厂，产地陕西，批号：03090418B），随机抽取各组大鼠血清各5份进行检测。

    2.2.2 检测程序 （1）用高效液相分析仪检测乌头碱标准品,确定此种碱类出现波峰时间。（2）用高效液相分析仪检测附子提取液，确定提取液中各乌头碱出峰时间及含量。（3）用高效液相分析仪检测各组大鼠血清，分析各组血清中乌头碱含量。

    2.2.3 检测设备 1100型高效液相色谱分析仪，中北色谱工作站,10 μL平头液相注射进样针,直径13 mm，滤径0.2 μm一次性针头滤器（水系，有机系）。

    2.2.4 检测单位 内蒙古中蒙医研究所。

    2.2.5 检测条件 1100型液相色谱仪，波长230纳米，流动相：甲醇-水-三乙胺（80:20:0.05），色谱柱YWG，C18，250X4.6，粒度10 μm，检测温度30.2℃，流速1 mL/min。

    3 实验结果

    3.1 一般状态观察结果 实验开始第1xx阴虚组大鼠出现好动，烦躁,饮水量增加等症状,第3周阴虚模型组大鼠出现毛发枯槁发黄及脱毛、消瘦、多动、易惊怕人，心率加快，体温升高，饮水饮食量增加，大便干结等表征。阳虚模型组第2周开始出现倦态，饮水饮食量下降，体温下降，到第3周出现体重及体温下降，畏寒蜷缩，反应迟钝，精神萎靡,体毛枯疏，失去光泽，饮水摄食减少，尿量增多等阳虚的表现。阳虚附子组大鼠表现基本正常，阴虚附子组大鼠第1、2周表现较阴虚组更为明显，第3、4周明显体力下降，但精神烦躁，易激怒，形体消瘦。空白附子组与空白组差异不大。上述表现说明，附子对阳虚动物模型有正性干预作用，能纠正其阳虚的情况而对动物的毒性作用小于xx作用。反之附子对阴虚动物模型则有负性干预作用，加重了其阴虚症状，毒性作用大于xx作用。

    3.2 各组大鼠血清乌头碱含量的测定结果

    3.2.1 乌头碱标准品检测 经检测新乌头碱出峰时间大约在5 min-6 min之间，乌头原碱出峰时间大约在7 min-7.5 min之间，次乌头碱出峰时间大约在10 min-12.5 min之间。由于检测时间不同，流动相配制略有不同，所以出峰时间出现偏差属正常情况。

    3.2.2 附子提取液检测 附子提取液分别用水提和醇提2种方法检测,各乌头碱出峰时间和标准品之间无差异。

    3.2.3 大鼠血清检测 样品分为9组，每组随机取5个样品进行检测，结果见表1。

    表1 大鼠血清中乌头碱检出情况从上面的结果可以看出，不同证候的机体对乌头碱的代谢能力不同，阳虚模型组的代谢能力大于阴虚模型及空白附子组，从而使其血清乌头碱含量接近正常空白组。附子毒性主要是由乌头类生物碱产生的，因此，从实验结果看附子对阳虚体质机体的毒性小于阴虚体质及正常体质，即附子在对证使用的情况下毒性降低。

    本次实验中未能对血清中乌头碱含量作定量的分析，原因是动物血清在高效液相色谱仪上有较大的吸收峰，影响了对乌头碱峰的xx测量。

    4 讨论

    中药毒性历来是一个重要的研究方向，徐宗佩教授提出的中药辨证毒理假说给中药毒性研究提出了一个新的方向：不能xx按照现代毒理学研究的方法来研究中药的毒性，要结合中医自身的特色，辨证地对待中药毒性。附子微辛，大热，有毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛之功效。现代研究表明，附子的主要有效成分乌头碱类生物碱具有强心、xx、xxxxx、镇痛、调节体温等功效［５］。

    附子的毒性成分是双酯型生物碱,其中主要是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等［6-8］。

    本实验检测大鼠血清中乌头类生物碱的含量可以反映其在大鼠体内的蓄积程度，从而推断乌头类生物碱对大鼠的毒性大小。从实验的结果可以看出，阳虚模型服用附子后体内乌头碱基本无蓄积，而阴虚模型则有一定程度的乌头碱蓄积，说明阴虚模型使用附子后较阳虚模型更容易出现毒副作用。综合各组大鼠一般状态的情况可以说明，中药的毒性在一定条件下是辨证存在的，只要合理用药、正确用药，可以避免或减少其毒性。

【参考文献】
［1］边宝林,司 南,王宏洁,等.附子单煎以及与浙贝母合煎后乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等有毒成分的含量变化研究［J］.中国实验方剂学杂志,2006,12（4）:9-10.

［2］沈绍群,李 林.甲状腺机能减退症动物模型研究进展［J］.华西医学,2006,21（2）:516-517.

［3］卢文丽,方肇勤.阳虚证动物模型的造模方法与评析［J］.上海中医药大学学报,2004,18（4）:45-47.

［4］付晓伶,方肇勤.阴虚证动物模型的造模方法及评析［J］.上海中医药大学学报,2004,18（2）:52-53.

［5］彭 波,杨华元.乌头、附子及其主要生物碱的研究进展［J］. 华西药学杂志,1993,8（3）:158-161.

［6］刘应泉.附子的药理作用［J］.国外医学:中医中药分册,1980,（1）:10.

［7］郑虎占,董泽宏,佘 靖.中药现代研究与应用［M］.北京:学苑出版社,1998:2579-2582.

［8］陈红钰,王亚芸,潘 黎,等.盐附子的遗传毒性研究［J］.毒理学杂志,2007,21（4）:340.