基金项目!安徽省教育厅自然科学基金重点项目!2003kj027zd\”
Supported by Key Research Projectsponsored by Education Departm ent
ofAnhuiProvince(2003kj027zd)
作者简介!赵金红!1978-\”# 女#硕士研究生#电话$0554-6659942#
E-m ail: zhaoer45@ sohu.com
通讯作者!王健#E-m ail$wangjian8237@ sina.com
慢性乙型肝炎患者 CXC 趋化因子 M ig的表达
赵金红 1
!王健1!江水清 2
!项桂菊 2
\”1
安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室!安徽 淮南 232001#2
淮南第
二矿工医院感染科!安徽 淮南 232057$
摘要!目的 探讨慢性乙型肝炎!乙肝\”患者 CXC 趋化因子 M ig 的表达水平及其与 HBV-DNA %丙氨酸转氨酶!ALT\”的
相关性& 方法 以实时 PCR 法动态检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞!PBM C\”内Mig m RNA 的表达水平#以趋化因
子与 GAPDH 比值为其最终含量& 以ELISA 法定量检测患者外周血中 M ig 蛋白含量& 结果 慢性乙肝患者 PBM C 内Migm RNA 表达水平为 0.6883!0.0693#与正常对照组相比差异有显著性(!<0.001)&M ig 血清浓度为(609.6!73.8)pg/m l#
与正常对照组相比差异有显著性(!<0.05)& 患者 PBM C 内Mig m RNA 与其外周血中 M ig 含量显著相关(\"! 0.7157#
!<0.001)#外周血中 M ig 含量与血清 ALT 水平显著相关(\"! 0.7220# !<0.001)#外周血中 M ig 含量与血清中 HBV-DNA
含量显著相关(\”! 0.7266#!<0.001)& 结论 慢性乙肝患者 M igm RNA 及血清 M ig 含量表达均增高#M ig 介导了肝脏炎症
细胞浸润#参与了乙肝慢性化病程&
关键词!乙型肝炎\’趋化因子\’M ig\’丙氨酸转氨酶\’实时 PCR
中图分类号!R512.62 文献标识码!A!!!!!!!!文章编号!1673-4254!2006\”11-1589-04
01 -(0(./0% /023+%2 45 /06%$*%$(0-! /0 786/106& 9/6: ;,$(0/; ,<786/6/& =
ZHNA Jin-hong1
,W ANG Jian1
,JIANG Shui-qing2
,XIANG Gui-ju2
1
Departm entofEtiologyand Im m unology, M edicalCollegeofAnhuiUniversity ofScienceand Technology, Huainan 232001, China;
2
Departm entofInfectiousDiseases,Second W orker\’sHospitalofHuainan,Huainan 232057,China
>4&6$8;6? @ABCD6/EC To studytheexpression levelsofm onokineinduced byinterferon-! (M ig) m RNA and itsassociation
with HBV DNA and alanineam inotransferase(ALT)in patientswith chronichepatitisB.FC6,(G& ThelevelofM igm RNA in
peripheralblood m ononuclearcells (PBM Cs) wasdynam ically detected with real-tim e quantitative PCR, and the ratio of
chem okine/GAPDH was considered to represent the final chem okine level. The plasm a level of was m easured by
enzym e-linked im m unosorbentassay (ELISA).HC&3I6& Them ean levelofM ig m RNA in PBM Csofthepatientswith chronic
hepatitisB was0.6883!0.0693,which wassignificantly higherthan thatin norm alcontrols(!<0.001).Theplasm aM ig level
in thepatientswas609.6!73.8 pg/m l,also significantly higherthan thatin norm alcontrols(!<0.05).In patientswith chronic
hepatitisB,thelevelofM ig m RNA in thePBM Cswassignificantly correlated with plasm a M ig level(\”! 0.7157,!<0.001),
and plasm aM ig levelwascorrelated with plasm a ALT level(\”! 0.7220,!<0.001)and plasm a HBV DNA level(\"! 0.7266,
!<0.001). J(0DI3&/(0 Both theexpression ofM ig m RNA in PBM Csand plasm aM ig concentration are elevated in patients
with chronic hepatitisB. M ig playsan im portantrole in m igration ofthe inflam m atory cellsto the liverand m ediatesthe
developm entofchronichepatitisB.
KC5 9($G&? hepatitisB;chem okine;m onokineinduced byinterferon-!;alanineam inotransferase;real-tim epolym erasechain
reaction
慢性乙型病毒性肝炎是以局部炎症为主要特征#
趋化因子是反应炎症活动的数量指标# 能够趋化%激
活中性粒细胞%单核细胞%NK 细胞%淋巴细胞等趋化
游走#在炎症部位聚集%活化#参与组织损伤和修复&
CXC 趋化因子 ! 干扰素诱生的单核因子!M ig\”与其
受体 CXCR3 相互作用#对表达该受体的 NK 细胞%T
细胞%单核 /巨噬细胞等活化%增殖#在机体抗感染%
抑病毒等过程中起重要作用&国内外已有关于该趋化
因子与丙型病毒性肝炎相关报道#但未见与乙型肝炎
相关性研究& 为了解 CXC 趋化因子 M ig 在慢性乙肝
致病过程中的作用# 本研究选择 45 例慢性乙肝患者
以实时 PCR 法动态% 定量检测 M ig m RNA 表达水
平#以ELISA 法定量检测血清 M ig 浓度#现将结果报
道如下&
1 材料和方法
1.1 临床资料
45 例慢性乙肝病人为 2004.1~2005.6 淮南第二
矿工医院收治的患者#其中男 25 例%女20 例#年龄
18~50岁#平均!30!9\”岁& 另选 24 例体检正常献血员
为对照#其中男 14 例%女10 例#年龄 20~48 岁#平均
2006;26(11) 南方医科大学学报(JSouth M ed Univ) 1589( (
Type Sense(5\’→3\’) Antisense(5\’→3\’) Length
GAPDH GGT ATC GTG GAA GGA CTC ATG AC ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AGC 188bp
M ig GGA ACT CCA TTC TAT CAC TAT TGG TGA AGT GGT CTC 414bp
表1实时 PCR 扩增应用的趋因子引物序列
01\’ \’*\”2-3()* &45 10 67&89 \”.: ;(<
Group !!!!!!! M igm RNA M ig(pg/m l)
Control 24 0.3921!0.0601 287.4!25.6
ChronichepatitisB 45 0.6883!0.0693 609.6!73.8
\”=17.6787 \”\’=26.4544
#<0.001 #<0.05
表2慢性乙肝患者 PBM C 内Migm RNA
表达水平及血清 M ig 含量
!\”#$= )5>7 *?@\’*++(1. A217B21<
67&89C (. &D;4+ \”.: @2\”2*E*2
(. @\”3(*.3+ F(3G /G\’1.(/ G*@\”3(3(+ D
!25!5\”岁# 临床诊断符合 2000 年西安全国病毒性肝
炎会议修订的诊断标准$1%
# 患者满足以下条件&血清
HBsAg(+)\’HBeAg(+)\’抗-HBc(+)和血清 HBV-DNA
阳性 (HBV-DNA>1.0\”103
copies/m l)( 丙氨酸转氨酶
(ALT)升高(且下限高于正常值 2 倍(上限小于正常
值8倍(80 U/L<ALT<320U/L)# 病程均超过 6 个月(
无合并 HAV\’HCV\’HDV\’HEV\’HIV 感染(无其他自
身免疫性疾病(3 个月内未系统用过抗病毒和免疫抑
制剂xx#
1.2 试剂与仪器
ELISA 血清 M ig 检测试剂盒购自美国 Sigm a公司)Trizol试剂盒购自美国 Invitrogen 公司)淋巴细胞
分离液购自上海试剂二厂#LightCyclerFastStart
DNA M asterSYBR Green I购自德国 Roche 公司# i-
Cyclez 荧光实 时定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司#
1.3 标本采集
采取患者晨起空腹静脉血 6 m l( 分别置于 2 支
含肝素的无菌抗凝 Eppendorf管和 4 支普通 Eppen-
dorf管# 抗凝管用于外周血单个核细胞!PBM C\”内趋
化因子Mig m RNA 检测(普通管用于血清Mig\’
HBV-DNA 含量检测(严格按照说明书进行操作#
1.4 实时 PCR 检测
以淋巴细胞分离液常规分离 PBM C( 用Hank\’s
液洗涤 2 次(以1640 xx培养液调整细胞数至(1~2)
\”106
个/m l# 以Trizol试剂抽提患者 PBM C 总RNA(
并逆转录为 cDNA( 置!86 #冰箱备检# 采用 SYBR
Green I荧光标记法检测 PCR 产物(总反应体系为 25
!l( 包括上下游引物各10 pm ol(M gCl2 2.5 m m ol(
Ex-Taq 1.25 U(dNTPs 0.2 m m ol(1\”PCR Buffer!500
m m olKCl(100 m m olTris(20 m g/m lgelatin(pH 8.3\”(
2\”SYBRTM Green!液# 2 \”l标准品或模板 cDNA(
模板cDNA 以1:4 稀释#趋化因子引物设计参照Shields等方法进行$2-3%
(趋化因子 M ig 的引物序列见
表1# 扩增反应参数如下&95 #预变性 300 s(95 #变性50 s(55 #退火 40 s(72 #延伸 90 s(共35 个循环(
{zh1} 72 #延伸 300 s# 为减少模板 cDNA 浓度等其他
因素对扩增效率的影响( 以趋化因子与管家基因
GAPDH 比值为其最终相对表达水平#
1.5 标准品和标准曲线的制备
采用管家基因 GAPDH 的PCR 产物为外参标
准# 为确定定量扩增的效率和灵敏度(将起始浓度为
1 ng!105
copies/\”l\”的GAPDH 按1:10 做连续的 4 个
梯度稀释(即105
\’104
\’103
和102
copies/\”l做为扩增标
准品绘制标准曲线#
1.6 统计学处理
为克服系统误差( 统计数据以趋化因子 log cD-
NA/log GAPDH 比值的均数! 标准差表示趋化因子
m RNA 表达水平(以排除在 RNA 提取和逆转录过程
中出现的变异# 组间差异采用 \” 检验(#<0.05 为差异
有显着性#
2 结果
慢性乙肝患者 PBM C 内Migm RNA 水平及血清
M ig 含量均升高( 与正常对照组比较差异有显著性
(#<0.001(#<0.05(表2)#慢性乙肝患者 PBM C 内Mig
m RNA 与其外周血中 M ig 含量显著相关!$\” 0.7157(
#<0.001(图1A\"(而正常人群体内二者无相关性!$\"
0.2742(#>0.10(图1B\”# 慢性乙肝患者外周血中 M ig
浓度与血清 ALT 水平显著相关!$\” 0.7220(#<0.001(
图2A\”(而正常人群体内二者无相关性!$\” 0.2709(
#>0.20(图2B\”# 慢性乙肝患者外周血中 M ig 浓度与
血清 HBV-DNA 含量显著相关 !$\” 0.7266(#<0.001(
图3\”#
3 讨论
趋化因子是能使细胞发生趋化作用的细胞因子
总称$4%
(分为 CXC\’CC\’C\’CX3C 四个亚家族!C 代表
半胱氨酸(X 代表任意氨基酸\”( 以CXC 和CC 亚家
南方医科大学学报(JSouthM ed Univ) 第26 卷1590* *
图1B 正常人群 M igm RNA 与血清 M ig 浓度相关性
0-100. 2345 067)088\”(. ,.9
7+,82, :\”; +0 9(.()8
!=0.2742
\”>0.10
100 200 300 400 500
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Plasm alevelofM ig(pg/m l)
mRNAexpressionofMig
(logcDNA/logGAPDH)
350
300
250
200
150
100
50
0
500 1000 1500
!=0.7220
\”<0.001
PlasmalevelofALT(U/L)
Plasm alevelofM ig(pg/m l)
图2A 慢性乙肝患者血清 M ig 浓度与血清
ALT 相关性
?\”;$@5 \’())0+,-\”(. A0-100. 7+,82, :\”; +0<0+
,.B 5CD \”. 7,-\”0.-8 1\”-= E=)(.\”E =07,-\”-\”8 &
!=0.2709
\”>0.20
40
35
30
25
20
15
10
5
0
100 200 300 400 500
PlasmalevelofALT(U/L)
Plasm alevelofM ig(pg/m l)
图2B 正常人群血清 M ig 浓度与血清 ALT 相关性
0+,-\”(. /0-100. 7+,82, :\”; +0<0+
,.B 5CD \”. =0,+-=> B(.()8
图3慢性乙肝患者血清 M ig 浓度与血清
HBV-DNA 含量相关性
?\”;$F \’())0+,-\”(. /0-100. 7+,82, :\”; +0<0+ ,.B
G&H IJ5 \”. 7K-\”0.-8 1\”-= E=)(.\”E =07K-\”-\”8 &
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
500 1000 1500
!=0.7266
\”<0.001
Plasmalevelof
HBV-DNA(copies/ml)
Plasm alevelofM ig(pg/m l)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
500 1000 1500
!=0.7157
\”<0.001
图1A 慢性乙肝患者 M igm RNA 与血清 M ig 浓
度相关性
?\”;$%5 \’())0+K-\”(. /0-100. 2L45 067)088\”(.
K.B 7+K82K :\”; +0<0+ \". 7K-\"0.-8 1\"-= E=)(.\"E
=07K-\”-\”8 &
Plasm alevelofM ig(pg/m l)
mRNAexpressionofMig
(logcDNA/logGAPDH)
族最为重要!不同趋化因子亚家族趋化不同的炎症细
胞\”5#
! CC 趋化因子主要趋化单核细胞$嗜酸性粒细
胞$嗜碱性粒细胞和 T 细胞!CXC 趋化因子按其分子
N- 端前是否存在谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(Glu-Leu-Arg) 即ELR 结构% 进一步分为 ELR+CXC
和ELR-CXC 两亚族%ELR+CXC 主要趋化中性粒细
胞%而ELR-CXC 趋化因子尤其是 ! 干扰素诱生蛋白
10 (IP-10)$M ig$ 干扰素诱生的T细胞趋化剂\”(I-TAC)均可由 IFN-! 诱导单核 /巨噬细胞$肝细胞$
成纤维细胞$角质形成细胞和内皮细胞等分泌%通过
其共同受体 CXCR3 对表达该受体的活化 T 细胞$
NK 细胞等趋化和xx%发挥抗感染$抑病毒等多种
生物学功能\”6-7#
!
本研究发现慢性乙肝患者 PBM C 内Mig m RNA
和血清 M ig 浓度均显著升高% 与对照组有显著性差
异%且二者具有明显相关性%正常人群则无相关性%此与Kakim i等\”8#
报道类似! Kakim i等利用转基因鼠模
型转导对HBV 特异的CTL% 发现CTL 能够分泌IFN-!$TNF-\” 等刺激肝细胞产生 M ig 和IP-10%趋化
非特异性单核细胞和其他炎性细胞浸润于肝脏!当阻
断这些趋化因子则减少了宿主源性单核细胞在肝脏
的浸润%降低了肝组织损伤严重性! Apolinario 等\”3#
利用RT-PCR 技术$ELISA 法研究表明 M ig m RNA 及Mig 蛋白含量在体外培养肝细胞株经感染 HCV 后表
达均增加! 最近 Bieche等\”9#
也证实 M ig$IP-10$I-TAC
在慢性乙肝患者中表达显著增高!而与 M ihm 等\”10#
报
道结果不同%M ihm 等通过 RT-PCR 技术发现慢性丙
肝患者中 IP-10 m RNA 和血清中蛋白浓度均表达