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香菇为口蘑科香菇属植物香蕈的子实体，黑木耳为木耳科木耳属植物黑木耳的子实体，二者均为人们所喜爱的传统的佐膳佳肴，除具有丰富的营养价值外，其中所含的多糖和氨基酸成分还具有较高的药用价值[1，2]。近年来国内外学者已对香菇和黑木耳中多糖和氨基酸的药效性作了大量的研究，发现其具有明显的抗衰老、xx、降血脂、增强机体免疫系统功能等多种生理活性[3，４]，并已提取出了多糖和氨基酸成分，但现未见对野生及人工培养的香菇和黑木耳多糖和氨基酸含量进行比较的报道[５]。因此，我们对云南野生及人工培养的香菇和黑木耳中粗多糖和氨基酸进行含量测定，并比较不同生长环境对粗多糖和氨基酸含量的影响，为更有效、经济地开发利用这些食品或研发多糖和氨基酸保健品提供参考依据[６]。
1 实验仪器、试剂与材料
1.1 实验仪器 
UV-1100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）、200g手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）、FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、超声波仪（上海声源超声波仪器设备有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）、电子恒温水浴锅（上海金桥科析仪器厂）。
1.2 试剂 
葡萄糖（AR,广东汕头市西陇化工厂,0501311）、苯酚（AR,天津市化学试剂三厂,20061208）、浓硫酸（AR,重庆川东化工有限公司化学试剂厂,20070112）茚三酮(AR,温州市华侨化学试剂有限公司,20070927)，丙氨酸(CP,上海伯奥生物科技有限公司,061016),冰醋酸(AR,汕头市达濠精细化学品公司,20070912),乙酸钠(AR,汕头市达濠精细化学品公司,20061013)。实验材料来自于云南大理市售的xx野生及人工培养品香菇和黑木耳，经自然晾晒至干而得。
2 实验方法及结果
2.1 粗多糖的提取及含量测定
2.1.1葡萄糖标准液的制备
精密称取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，用蒸馏水溶解并定溶到100ml的容量瓶中,摇匀,备用。
2.1.2 葡萄糖标准曲线绘制
  精密量取2.1.1中制备的葡萄糖标准液各0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00ml于7个50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。再用移液管分别量取这七种溶液2.00ml于7支具塞试管中,依次加入1.00ml 5%苯酚溶液,摇匀后再迅速加入5.00ml 浓硫酸,迅速混匀,静置5min,于沸水浴中加热15min后用冷水迅速冷却至室温。{zh1}以第1管中未加入葡萄糖的做空白对照，用UV-1100紫外分光光度仪于490nm处测定其吸光度值,以吸光度值（A）对葡萄糖浓度（C，ug/ml）作回归处理,得出回归方程为:A=-0.0579,B=0.0149,r=0.9994,即A=0.0149C-0.0579,线性范围为:10～60ug/ml[７]。
2.1.3 粗多糖的提取　
分别称取野生及人工培养的香菇和黑木耳干燥粉末各1.0000g,采用超声波浸提法,以料水比为1:30,提取2小时,抽滤,剩余残渣再用30ml水浸提2小时,抽滤,所得滤液与{dy}次滤液混匀并定容在100ml容量瓶中[８]。
2.1.4 精密度试验　
取同一样液,按2.1.2测定方法操作,重复测定其吸光度5次。由实验数据计算得RSD为0.23%[９],结果表明该方法精密度良好。
2.1.5 稳定性试验　
取同一样液, 按2.1.2测定方法操作,每隔0.5小时测定一次吸光度。实验测定结果表明在3小时内测定值不变。
2.1.6 重复性试验　
对同一样液重复取样5次, 按2.1.2测定方法操作,分别测定其吸光度。由实验数据计算得RSD为0.40%。
2.1.7 回收率试验　
采用加样回收法:取多糖提取液1.50ml6份于6只试管中,分别加入各浓度葡萄糖标准液0.50ml, 按2.1.2测定方法操作,分别其吸光度,并根据葡萄糖的检出量,计算其回收率[10]。结果见表1。
2.1.8 野生及人工培养香菇和黑木耳中多糖含量测定　
取2.1.3中四种样液各5.00ml,分别定容于50ml容量瓶中,摇匀。 再分别取这四种稀释液各2.00ml于4只试管中,各加1.00ml 5% 苯酚溶液,摇匀后迅速加5.00ml浓硫酸,立即混匀,静置5分钟后于沸水浴中加热15分钟,取出用冷水迅速冷却至室温,{zh1}测定四管的吸光度,空白对照同样为未加入样液,其它条件同2.1.2 [11]。平行实验操作三次，测定结果见表2。
2.2 游离氨基酸的提取及含量测定
2.2.1 溶液的配制
氨基酸标准液的制备 
 精密称取于105 ℃干燥至恒重的L-丙氨酸0.1000g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，即得1 g/L的溶液。
茚三酮试剂的制备: 
 称取0.25g茚三酮溶于50ml蒸馏水中制得5g/L的茚三酮水溶液[13]。
醋酸钠-醋酸缓冲溶液的制备:  
称取醋酸钠晶体54.6 g，加入无水醋酸1.2 g，配制成500mlPH为6的缓冲溶液，定容,摇匀，备用[14]。
2.2.2 L-丙氨酸标准曲线的绘制 
分别吸取1 g/L氨基酸标准液0 、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0ml于容量瓶中，用缓冲液定容至50ml，得到为60、70、80、90、100mg/L的氨基酸浓度。然后分别精密吸取上述试液5 ml于5支试管中，对照试管取5ml蒸馏水，再向各只试管加入1.0ml茚三酮试剂，加塞并摇匀。将6只试管置于沸水浴(92 ℃)中25分钟，溶液变为蓝紫色，冷却至室温，在569nm下测其吸光度值[15]。以吸光度(A)对浓度(C)作回归处理，得到的回归方程为：A=0.0152C-0.7928，r=0.9987，线性范围为：60～100mg/L。
2.2.3 供试品溶液的制备
称取粉碎过筛干燥好的香菇、黑木耳各1.00g，分别加入30ml蒸馏水，在60℃下超声（600W ,55 KHz）提取1小时[16]。过滤后将残渣再提取一次，合并滤液，用蒸馏水定容至100ml。
2.2.4 氨基酸含量测定 
分别吸取提取液5.0ml，用PH=6的醋酸钠-醋酸缓冲液将香菇提取液稀释至50ml，黑木耳提取液稀释至25ml，定容，摇匀即得样品液。按2.2.1测定方法进行操作，测其吸光度，代入下式计算总氨基酸含量。氨基酸含量(%)=〔C/(W×1000)〕×{bfb},式中C为供试样品按本法测定的质量浓度,W为供试样品质量浓度,以L-丙氨酸计样品中总氨基酸含量。
2.2.5 精密度试验 
取同一样品液，按2.2.1方法重复测定吸光度5次。野生及人工培养香菇的RSD为0.06%、0.08%，野生及人工培养黑木耳的RSD为0.09%、0.07%，结果表明该方法精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 
取同一样品液，按2.2.1方法每隔0.5小时测定吸光度一次。测定结果表明样品溶液在3小时内稳定。
2.2.7 重复性试验 
对同一原料，按相同操作方法重复提取3次，测定吸光度。野生及人工培养香菇的RSD为0.83%、0.88%，野生及人工培养黑木耳的RSD为1.31%、1.27%，结果表明该方法具有良好的重现性。
2.2.8 回收率试验 
精密吸取同一样品液9份，分别精密加入高中低三种浓度不同的L-丙氨酸标准溶液，按2.2.1方法测定吸光度。回收率平均值为99.5%，RSD为0.06%。
2.2.9 样品含量测定 
各取样品3批，按2.2.3供试品溶液的制备方法进行处理，并按2.2.4方法进行测定，结果见表3。野生及人工培养香菇的游离氨基酸含量为14.54%、12.57%，RSD为0.83%、0.88%；野生及人工培养黑木耳的游离氨基酸含量为8.83%、7.43%，RSD为1.31%、1.27%。
 

表1  葡萄糖加样回收试验结果
样品含量
（ug） 加入葡萄糖量（ug） 实际测得量
（ug） 回收率
(%) 平均回收率(%) RSD%
63.45 5 68.98 99.31% 99.45% 0.47%
63.45 10 73.09 99.51%  
63.45 15 78.62 100.22%  
63.45 20 82.48 98.84%  
63.45 25 88.12 99.63%  
63.45 30 92.67 99.17%  
 

表2  野生及人工培养香菇、黑木耳中多糖含量测定
含量品种 样品质量（g） 多糖含量（%） 平均值（%）
野生香菇 1.0056 9.52％ 9.52％
 1.0012 9.42％ 
 1.0103 9.61％ 
人工培养香菇 1.0034 8.46％ 8.36％
 1.0026 8.35％ 
 1.0017 8.28％ 
野生黑木耳 1.0049 8.64％ 8.54％
 1.0031 8.55％ 
 1.0019 8.43％ 
人工培养
黑木耳 1.0057 7.82％ 7.77％
 1.0038 7.68％ 
 1.0063 7.86％ 
注：野生香菇和黑木耳的粗多糖含量为9.52%和8.54%，人工培养香菇和黑木耳的粗多糖含量为8.36%和7.77%，对野生和人工香菇和黑木耳中这两组数据作统计学t检验[12]（P＞0.05），故野生和人工培养之间无显著性差异。
表3  野生及人工培养香菇和黑木耳中游离氨基酸含量 
原料名称 样品吸光度 氨基酸含量 氨基酸平均含量
野生香菇 0.319
0.305
0.312 14.63%
14.40%
14.58% 14.54%
人工香菇 0.184
0.154
0.163 12.68%
12.46%
12.57% 12.57%
野生黑木耳 0.557
0.558
0.545 8.89%
8.91%
8.70% 8.83%
人工黑木耳 0.349
0.330
0.321 7.56%
7.40%
7.33% 7.43%
3 结果讨论
本实验采用热水浸提结合超声波法来提取香菇和黑木耳中的粗多糖和游离氨基酸含量，并用苯酚－硫酸法测定出各自的粗多糖含量，得到野生和人工培养的香菇中粗多糖含量分别为9.52％和8.54％，野生和人工培养的黑木耳中的粗多糖含量分别为8.55％和7.83％。粗多糖含量野生品比人工培养品略高些，但无显著性差异，说明野外生长环境和人工培养的生长环境对香菇和黑木耳中的粗多糖含量影响不大。采用茚三酮比色法测定游离氨基酸含量简便、准确、重现性好，但值得注意的是此方法用于测定时受多种条件的影响,如PH、温度、水浴加热时间等。本次实验我们确定提取时间的方法为：准确称取1g 香菇和1g 黑木耳，加入30ml蒸馏水，于60℃下进行超声提取，分别于20，40，60，80，100分钟时，取出1ml提取液测定游离氨基酸含量。结果显示，40分钟以后，游离氨基酸含量没有变化,为尽可能提取充分，我们选择60分钟为提取时间。从测定结果来看，无论是香菇还是黑木耳，野生与人工培养品中的游离氨基酸含量没有显著差别，但是香菇中的游离氨基酸含量高于黑木耳。