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一步法质粒PCR定点突变实验方法 PCR Site Directed Mutagenesis Dpn I | PCR实验室 - 生技论坛-科研人的交流社区! - Powered by PHPWind
2010-06-29 23:16:56
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只需通过基于PCR的突变质粒的合成,和基于Dpn I的模板质粒的消化,转化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒(参考图1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
参考图1,使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等xx,在xx中会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理,可以消化掉待突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化xx后,质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
使用说明:
1. 引物设计:
用于特定基因突变的引物需要单独设计,请参考如下一些基本原则进行设计:
(1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条,然后就可以得到互补的另一条引物。
(2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
(3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足4X(GC碱基数)+2X(AT碱基数)≥45。但引物也不宜过长,否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右,且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag,其中蓝色的aag为突变位点,则左侧:4X(GC碱基数)+2X(AT碱基数)=4X8+2X7=46≥45右侧:4X(GC碱基数)+2X(AT碱基数)=4X8+2X8=48≥45
(4) 在可能的情况下,尽量把引物的GC含量控制在40%-60%。
(5) 在可能的情况下,尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
(6) {zh0}使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制:
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol,另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水,配制成浓度为100μM,在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中,再加入160微升水,混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择:
选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒,并且每一个50bp左右的局部GC含量{zh0}也不超过70%。如果GC含量过高,请先把目的基因克隆到其它合适的载体上,再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量{zh0}也在40-55%的范围,并且每一个50bp左右的局部GC含量{zh0}也不超过70%。如果目的基因GC含量过高,而突变位点不在高GC含量区域,可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来,进行定点突变,然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板,或者有局部高GC含量的质粒模板,请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。必需使用从dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam+的,包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应:
(1) 如下设置基因定点突变反应体系:
Nuclease-Free Water ?微升
Reaction Buffer(10X) 5微升
引物(10μM each) 2微升
dNTP Mix(2.5mM each) 4微升
待突变模板质粒(0.5μg) ?微升
总体积 49微升
按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中,根据待突变模板质粒的量,计算出需加入的Nuclease-Free Water的量,使总体积为49微升。适当混匀后,加入1ul Pfu DNA Polymerase,混匀。如果用的PCR仪没有热盖,在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
(2) 按照如下参数设置PCR仪:
步骤
循环数
温度
时间
说明
1
1
95℃
1分钟
最初变性
2
18
95℃
40秒
变性
60℃
1分钟
退火
68℃
1分钟/kb
延伸
3
1
72℃
10分钟
延伸、补全
4
1
4℃
长时间保持
暂时存放
说明:上面表格中1分钟/kb表示,如果待突变的质粒为6kb,那么68℃的延伸时间为6分钟。
5. Dpn I消化:
PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I,混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪
上进行,也可以在水浴锅中进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定:
感受态xx的转化效率必需至少在107以上,否则很难得到克隆。根据所使用的感受态xx,加入尽
量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态xx中可以加入5-10微升经过
Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态xx的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的
办法,把所有被转化后的xx,全部涂布到含有适当xxx的平板上,培养过夜。通常会得到50个
以下的克隆。如果发现克隆有上千个,那么肯定是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆,可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小
与预期结果是否相符。
取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序,以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2
个克隆中会得到一个预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素,会测序了3-5个克隆才得到一
个预期的突变克隆。
常见问题:
1. 转化后没有克隆或克隆数极少:
(1) 感受态xx效率不够高,请检测一下感受态细胞的效率,确保转化效率在107以上,当然高一些更好。
(2) 把Dpn I消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀,然后溶解在较小的体积中。这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3) 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟,循环中95℃变性的时间延长至1分钟,把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb,退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down,退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
(5) 如果使用矿物油(mineral oil),在转化时如果把矿物油带入感受态菌,会严重影响转化效率。
2. 有克隆,但没有或很难检测到预期的突变克隆:
(1) Dpn I消化效果不佳。一种可能是加入Dpn I后,由于该酶在甘油中,会迅速下沉,如果没有混匀就会严重影响Dpn I的消化作用。另一种可能是Dpn I由于保存不当或保存时间过长等原因导致活性下降,这时可以适当延长消化的时间至1.5-2小时。
(2) 使用的待突变的模板质粒量过多,导致Dpn I消化时不xx。我们这里推荐的模板质粒用量0.5微克,已经是模板质粒用量的上限,不能再使用更多的模板质粒了。
(3) 尽量避免多次反复冻融dNTP。可以把dNTP适当分装后再使用。
3. 有突变克隆,但突变位点不是预期的位点:
(1) 引物设计不佳,并且PCR反应中退火温度过低,导致引物退火到错误的地方。
(2) 引物质量较差,没有经过PAGE纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物,容易导致非预期的突变。
引文来源
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