隐孢子虫(Cryptosporidium)和甲第鞭毛虫(Giardia)是两种致病性原生动物，可引起人感染患病，分别称为隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)和甲第鞭毛虫病(Giardiasis)，其临床主要表现为急性腹泻或霍乱样水泻，可能伴随xx、恶心和呕吐等。该病目前尚无安全有效的xx措施、免疫能力正常的患者一般能在1周至1个月内自行痊愈；但免疫能力缺陷者和儿童感染该病可能因长期腹泻而导致营养不良、脱水、甚至危及生命。
近年来的调查研究表明：水和食物污染是隐孢子虫和甲第鞭毛虫的重要传播途径。据不xx统计，自1976年伯温隐孢子虫(C.Parvum)被确认为人的病原体以来，美国、英国、加拿大、澳大利亚等许多国家相继都报道了水源性隐孢子虫病和甲第鞭毛病的爆发流行。其中，1993年3至4月份、美国Wisconsin州Milwaukee市一个以Michigan湖地表水为水源的水厂出厂水受C.parvum污染，导致了40万人受感染。我国自1986年开始有隐孢子虫病的报道，相关调研表明我国隐孢子虫和甲第鞭毛虫分布也比较广泛。
近二十年未，隐孢子虫和甲第鞭毛虫的危害引起了国际社会的广泛xx，国环保局(EPA)与有关国家相关部门和科研机构对隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法，水处理工艺和xx对其去除和灭活，以及如何防止其污染等开展了系统研究。本文就隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法及其活力和感染性的评估两方面作一简要综述。
1、ICR、1622和1623等EPA检测方法
1.1、ICR方法(Information Collection Rule)
该方法用孔径为1μm的纤维缠绕式滤筒过滤来浓缩大量水样，被截留的颗粒物从滤筒中洗脱后，通过离心的方法浓缩，然后利用蔗糖密度梯度离心的方法将生物颗粒与非生物颗粒分开，再用单克隆免疫荧光抗体未标记隐孢子虫和甲第鞭毛虫，以增加其在荧光显微镜检中的检出率。
本方法的缺陷是洗脱、浓缩和纯化等步骤容易造成隐孢子虫卵事囊(oocyst)和甲第鞭毛虫包囊(cyst)的损失，从而导致回收率低；镜检依赖于分析人员的经验和专业背景知识，主观性较大；另外，本方法不能确定卵囊的活力和感染性等等。
1.2. 1622和1623检测方法
为克服ICR方法回收率低等的不足，美国环保局1996年开始采用免疫磁力分离(IMS Immunomagnetic Separation)等新技术对隐孢子虫进行分析监测，提出了单独检测隐孢子虫的1622方法，并于1999年1月将其作为一个正式的检测标准发布。由于甲第鞭毛虫免疫磁力分离系统的建立落后于隐孢子虫，于1998年10月才被认可，因此，EPA于1999年2月才发布能同时检测隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法，为将其与1622方法相区别，称其为1623方法。
1623方法采用滤筒过滤，免疫磁珠分离和免疫荧光(IFAImmunof luorescent Assay)显微镜检来检测和计数隐孢子虫和甲第鞭毛虫，并借助DAPI染色和微分干涉(D.I.C Differential Interference Contrast)显微镜检观察其内部的特征结构来证实卵囊和包囊的存在。以下从过滤、洗脱、离心浓缩、IMS分离纯化、荧光染色、荧光镜检、微分干涉镜检和质量控制等方面介绍1623方法的实验过程。
1.2.1. 过滤
本方法采集10L未经处理水祥，要求水样在0—8℃保存，24小时内运抵实验室。采用Pall Gelman Enviro—checkTM等滤筒过滤浓缩水样，过滤水样流速为2LPM。与ICR方法中使用的滤筒相比，Enviro—check滤筒凭借其1健m滤膜的坡相设计增加了过滤水样体积和截留、复现隐抱于虫和甲第鞭毛虫的效率。
l.2.2.洗脱
与ICR方法相比，1623方法将滤筒中截获的隐袍子虫和甲第鞭毛虫从滤膜上洗脱下未的方法也大有改进。其在滤筒中加入洗脱缓冲液后，利用摇臂振荡器的水平间歇物理振荡(600rpm)将隐孢子虫和甲第鞭毛虫从滤膜上洗脱下来，提高了回收率。
1.2.3.离心浓缩
洗脱悬液于1100×G离心，弃上清，根据沉淀多少加入适量缓冲液重新悬浮，悬浮液被转移至平边样品管(flat—sided sample tube)中。
1.2.4. IMS分离纯化
1.2.4.1.卵囊、包囊与磁珠抗体结合
向悬浮液中加入抗隐孢子虫的磁珠抗体(Dynabeads R Crypto—combo)和抗甲第鞭毛虫的磁珠抗体(Dynabeads R Giardia—combo)，抗原抗体反应使卵囊和包囊分别与其磁珠抗体结合，形成复合体。
1.2.4.2. 卵囊、色囊与杂质的分离
卵囊、包囊由于与其磁珠抗体偶联，被磁珠收集器(MCP—1)磁力吸附在样品管壁上、杂质则随上清被去除。卵囊、包囊被转移至微量离心管后在另一个磁珠收集器(MCP—M)上再次被分离纯化。
1.2.4.3. 卵囊、色囊与磁珠的解离
为xx磁珠对卵囊、包囊染色和镜检的干扰，染色前必须将磁珠抗体与卵囊和包囊分离。本方法采用加酸酸化，剧烈振荡解离，利用磁珠收集器(MCP—M)磁条吸引磁珠而达到将其从悬浮液中分离除去的目的。悬浮有包囊和卵囊的上清被转移至井型载玻片的计数井中。
l.2.5. 荧光染色
向并型载玻片计数井中分别加入Meridian Diagnostics 直接标记试剂盒中的检测试剂(Detection Reagent)和反染色剂(Counterstain)，保温后加洗涤缓冲液洗去多余的检测试剂和反染色剂，然后加DAPI染色，加封片介质封片，显微镜检。
l.2.6. 荧光镜检与微分干涉(D.I.C)镜检确认
按从左到右或从上到下的扫描模式镜检计数井。发现形状和大小与隐孢子虫和甲第鞭毛虫特征吻合的具明亮苹果绿荧光目标时，转换紫外激发块检查细胞核等DAPI染色特性。再微分干涉检查其外形特征和子孢子、中体、轴柱等内部特征结构。从而确认目标为隐孢子虫卵囊或甲第鞭毛虫包囊。
1.2.7. 质量控制
本方法执行严格的质量保证程序，要求进行初始精密度和回收率(IPR)，加标水样分析(MS／MSD)、阳性对照(OPR)和阴性对照等测试。
1.2.7.1.初始精密度和回收率(IPR Initial Precision and Recovery)对四份加标水祥进行过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、染色和荧光显微镜检，计算四个分析结果的平均回收率和回收率的相对标准偏差，如果这两项均满足本方法初始精密度和回收率要求，则可进行空白和样品分析，否则应找出原因，并重新进行IPR质控实验。
1.2.7.2.加标和平行加标(MS／MSD Matrix Spike/Matrix Spike Duplicate)
为确定不同来源水样对本方法卵囊和色囊回收率的影响，开始检测任何一个不同来源的水样时，须平行采集第二份水样进行加标分析、加标数量应为该水样或IPR数量的五倍，或为OPR数量。计算回收率，若此回收率不在本方法规定的范围之内，说明该样的检测结果不可接受；若同批的方法空白和OPR在控制范围内，则说明是水样的干扰导致回收率降低；如果方法空白不在它们的控制范围之内，则证明实验室存在干扰实验因素；须找出原因，排除干扰，重新采样分析。
平行加标实验过程同上，只是同时平行加标两个水样，计算MS与MSD平均回收率，判断其是否在本方法规定的范围之内。
1.2.7.3. 阴性对照(方法空白)
以纯水作方法空白，以判断实验操作过程是否带进污染、一般在IPR、OPR和水样分析前进行，每周或每检测20个水样作一次空白。如果在空白中发现卵囊、包囊或干扰性物体，应立即停止检测水样。找出污染源，排除污染后，重新进行空白实验。
1.2.7.4. 阳性对照(OPR Ongoing Precision and Recovery)
向纯水中加标隐孢子虫卵囊或甲第鞭毛虫包囊，经过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、染色、镜检分析。每周或每检测20个水样进行一次OPR分析。同批水样中，首先镜检OPR，要求至少50％色囊或卵囊外形完好，未受损伤，荧光镜检时，包囊或卵囊的形态特征必须符合其鉴定标准。否则，应找出对卵囊或色囊造成损伤的操作步骤或试剂，排除后重新进行OPR分析，OPR回收率必须在本方法规定的范围之内。
EPA数据显示：与ICR相比，1622和1623方法大大提高了卵囊和包囊的检出率。但1622和1623方法不能分辨隐孢于虫和甲第鞭毛虫的种类和宿主。而且，由于免疫荧光抗体是与卵囊外表面上特异性位点免疫结合，即使卵囊裂囊释放子孢子后，空卵囊壳仍会被检测到。因此，本方法去不能区分空壳无活性卵囊和有活力、具感染性的卵囊，即无法评估其活力和感染性。
另外，隐孢子虫的免疫荧光分析方法特异性高使其适用于高浊水、甚至土壤样品、但不适用于经氯xx水样，因为抗体特异性位点上的碳水化合物被氯氧化后易丢失，互隐孢子虫表面抗体特异性位点随年龄，环境条件而降低其有效性；有些生物体(如部分藻细胞)具xx荧光或抗体的非特异性结合易导致检测结果偏高。
2.隐孢子虫活力和感染性的评估方法
对隐孢子虫和甲第鞭毛虫的存活能力的研究表明：甲第鞭毛虫存活能力差，且现行的检测分析方法的样品处理过程对其活力有相当大的影响。因此，目前的检测分析方法只能检测甲第鞭毛虫存在与否，不能评估其活力和感染性。而隐孢子虫对环境因素和消毒剂的抗性都比较强，样品处理各环节对其活力影响非常小。因此，目前的研究工作主要集中在隐孢子虫的活力和感染性评估方面。分析方法主要包括：裂囊分析、活性染色分析、动物实验、细胞培养和分子生物学方法等。
2.1.裂囊分析(Excystation)
裂囊分析是将隐孢子虫卵囊置于近似于人体肠道的环境条件下(如：低PH(2.O)、胆盐、37℃等等)，致使隐孢子虫卵囊外膜破裂，释放出于孢子，然后显微镜检、计数未裂解的卵囊数目与裂囊后产生的子孢子数目，以此计算有活力卵囊的百分比。
2.2. 活性染色分析(Vital Staining)
活性染色分析是基于隐孢子虫卵囊外半透膜选择性摄入荧光素DAPI或P I的特点来判定卵囊有无活力。该方法用于指示卵囊是否具有潜在的活性和感染性有较大价值。
2.3.动物实验
动物模型是评价隐孢子虫感染性的传统方法，也是最可靠的方法。一般采用新生CD1小鼠模型作为感染性测定的标准。实验过程包括：向新生小鼠注射隐孢子虫卵囊，保温，处死小鼠，解剖肠道，显微镜检组织细胞来判定感染是否发生。除需牺牲动物外，该方法费时，繁琐，非常昂贵、需要经验丰富的动物专家来参予完成。
2.4. 细胞培养(Cell Culture)
目前细胞培养方法开始逐渐取代动物实验而作为评估隐孢子虫感染性的可靠方法。该方法用细胞(特别是人肠道上皮细胞HCT—8)作为寄主，向细胞中加入被检样品，保温，计数受感染细胞数目。该方法只检测有感染性的卵囊，检测限可低至一个有感染性的卵囊。与动物实验相比，该方法降低了费用，简化了实验操作，增加了可重复性。
2.5.分子生物学方法(Molecular Biotechnology)
2.5.1.直接杂交
用放射性或荧光标记单链DNA探针(其序列是隐孢子虫特异性的)，将被检样品加热，使其染色体变性后，加入探针，冷却后被分开的DNA链退火，探针可与其互补序列结合，检测探针可知隐孢子虫存在与否。
由于DNA量较少，该方法不灵敏。另外，当探针序列不是隐孢子虫特有的时，易出现假阳性。
2.5.2.聚合 (PCR Polymerase Chain Reation)
直接杂交灵敏度低的不足可用PCR扩增产生目标DNA的多个拷贝来解决。目标DNA是隐孢子虫特异性DNA片断，每条链对应一条引物，引物与变性的隐孢子虫染色体DNA退火结合，在DNA聚合酶催化下起始合成反应，经过多个循环，可扩增出足量的DNA，然后借助凝胶电泳，染色、紫外观察等方法来检测PCR产物。
利用PCR技术检测隐孢子虫时，引物的设计非常重要、因为如果样品中含有与引物序列互补的杂质DNA，其也可被扩增。因此、该方法对DNA污染敏感，一般可采用免疫磁力分离纯化后再作PCR的方法来提高PCR特异性。另外，还可根据特异性要求(如隐孢子虫属特异性或隐孢子虫特定种特异性) 未设计引物以达到鉴定隐孢子虫种类的目的。
PCR不能检出卵囊空壳，但若死卵囊中的染色体DNA未被破坏，其仍能被检出。为只检出有活力卵囊，一般先诱导隐孢子虫卵囊裂囊，然后对活性子孢子作PCR，该方法可检出低至100个子孢子或相当于25个卵囊。
2.5.3. 反转录PCR(RT—PCR)
普通PCR是针对染色体DNA的，由于染色体DNA在卵囊死后仍可能在较长时间内保存完好，因此，普通PCR有时能检出无活力的卵囊。研究表明，有活性的细胞才能产生mRNA。反转录PCR正是基于检测编码热激蛋白hsp70(heat shock protein 70)的mRNA来检测有活性的卵囊的。该方法通过热激隐孢子虫卵囊，诱导其产生保护性的热激蛋白mRNA，利用多次冻融(液氮／65℃)破碎卵囊，立即抽提mRNA，将mRNA反转录成单链DNA，用PCR扩增DNA产物，再用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，硝酸银或溴化乙锭染色，在可见光或紫外光下观察未判断DNA产物。DNA产物量不足以直接观察时，可将DNA转移到尼龙膜上作southern杂交。应用RT—PCR检测限可低至1个卵囊。
2.5.4. 嵌套PCR(nested PCR)
嵌套PCR方法先通过应用PCR用一对引物来扩增隐孢子虫特异性的目标DNA，经纯化后，再用另外一对不同的引物扩增来提高PCR的特异性，这就大大减少了因包含引物互补序列的杂质DNA而被非特异性扩增的可能性。
2.5.5. 荧光杂交(FISH，fluorescent in situ hybridisation)
FISH 是由悉尼多所大学学者在UK Thames Water和USA Becton Dickinson的帮助下发展起来。该方法将具荧光标记的寡核苷酸探针导入卵囊内部，使之与子孢子18S核糖体RNA(rRNA、ribosomal RNA)结构结合，DNA探针标记了一个能在显微镜，扫描仪和细胞仪下被观察到的荧光标记。由于卵囊失活后其rRNA结构很快被破坏。因此，FISH方法仅标记有活力的卵囊。
通过比较C.Parvum与其它种类的隐孢子虫和其它原生动物的rRNA结构，可以设计出C.Parvum特异性的ONA探针，利用该探针可以仅仅特异性地标记c.Parvum卵囊，而不标记隐孢子虫的其它种类，从而达到作种类鉴定的目的。
以上介绍的隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法及其活力和感染性评估方法各有优缺点，其他新检测技术（如酶联免疫吸附（ELISA）和流式细胞仪（ELISA)和流式细胞仪（Flow Cytometry）也正在逐步应用于此领域，可以预计同时采用多种先进检测手段的检测方法将大大提高检测的准确性，加快检测速度，降低实验费用。
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参考文献：
1、jenkins,M.B.,Anguish, L. J.,Assessment of a dry permeability assay for determination of inactivation rates of Cryptosporidium parvum oocysts. Appl environ microbiol.63:10pp.3844-3850.1997.
2.Deng,M.Q.,Cliver, D. O.,Immunomagnetic capture PCR to detect viable Cryptosporidium parvum in soil. Appl environ microbiol.64:6pp.3134-3138.1997.
3. Walker, M. J.,Montemagno, C.,Method detection limits of PCR and immunofluorescence assay for Cryptosporidium parvum in soil. Appl environ microbiol.64:6pp.2281-2283.1998.
4. Sluter,S. D, Tzipori, S.,Parameters affecting polymerase chain reaction detection of waterborne Cryptosporidium parvum oocysts.Appl microbiol biotechnol.48:3 pp.325-330.1997.
5. Kaucner, C. and Stinear, T.Sensitive and rapid detection of viable Giardia cysts and Cryptosporidium parvum oocysts in large-volume water samples with wound fiberglass cartridge filters and reverse transcription-PCR. Appl environ microbiol 64: 5pp.1743-1749.1998.
6. States,S.Protozoa in River Water:Sources,Occurrence and Treatment. JAWWA,89:74-83.1997.
7. LeChevallier, M.W.,et al.1995. Evaluation of the imunofluorescence procedure for Detection of Giardia Cysts and Cryptosporidium Oocysts in Water.AEM,61:690-697.
8. USEPA.Method 1622:Cryptosporidium in Water by Fitration/IMS/FA.EPA-821-12-97-023.1997.
9. USEPA.Method 1622:Cryptosporidium in Water by Filtration/IMS/FA.EPA-821-12-97-023.1997.
10. Finch,G.R.et al. Ozone Inactivation of Cryptosporidium parvum in Demand-Free Phosphate Buffer Determined by In Vitro Excystation and Animal Infectivity. AEM, 59:4203-4210.1993.
本文来自: 环境技术网(www.65et.com) 详细出处参考：http://www.65et.com/h2o/1/200707082078.html
