纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备

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作者： 朱立成 , 张耀洲　　浏览次数：8　　发表时间：2009-10-8 14:48:22

纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备
朱立成 , 张耀洲

摘　要:纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶.本研究将编码信号肽、前导+肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a 中 ,获得重组表达质粒pETNK.将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21 中 ,经 IPTG诱导表达. SDS2PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达 ,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为 31kD. 亲和层析法纯化表达产物 ,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔 ,制备兔抗纳豆激酶血清 ,用 ELISA 和 Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定.纤维蛋白平板实验显示 ,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性.

关键词:纳豆激酶; 原核表达; 抗体制备; 纤溶活性
纳豆激酶 nattokinase ,NK 是一种从日本传统食品纳豆 natto 中提取的具有强烈溶纤作用的丝氨酸蛋白酶.该酶能显著溶解体内、外血栓 ,明显缩短纤维蛋白的溶解时间 ,并能xx静脉内皮细胞产生纤溶酶原xx剂 . NK最初合成产物是 381 个氨基酸残基的前纳豆激酶原 pre2pro NK ,其中 N端第 1～23 氨基酸是信号肽 ,第 24～106 氨基酸为前导肽,在分泌过程中 ,N 端 106 个氨基酸残基被切除而形成 275 个氨基酸的成熟肽 .本研究克隆了包括编码信号肽、前导肽和成熟肽的纳豆激酶基因，并在大肠杆菌中得到表达. 表达产物通过亲和层析柱纯化后制备了抗纳豆激酶多克隆抗体 ,并用纤维蛋白平板法检测了纳豆激酶融合蛋白的溶纤活性.

1           材料与方法
1.1           菌株及载体
纳豆杆菌菌种由浙江大学食品科学系保存 ,大肠杆菌表达载体 pET28a 、E. coli. TG1、BL212( )DE3 等由浙江理工大学生物化学研究所保存.

1.2 　酶和化学试剂
电泳级琼脂糖、限制性内切酶、T DNA 连接酶、PCR 产物纯化试剂盒购自 ROCHE 公司; PCR试剂购自上海生工生物工程公司 , DNA 序列由浙江理工大学生物化学研究所测定;亲和层析柱 Hi2TMTrap Chelating HP、Akta explorer100 快速纯化系统购自 Amersham Biosciences 公司; HRP 标记的羊抗兔 IgG购自华美生物工程公司;牛血纤维蛋白原、牛血纤溶酶原和凝血酶等购自中国药品生物( )制品检定所;洛欣 注射用尿激酶 购自广东天普生化医药股份有限公司;新西兰大白兔购自浙江大学医学院实验动物中心.其他化学药品为国产分析纯
试剂.xx基因组 DNA 提取、质粒 DNA 提取、低熔点胶回收、连接反应等均按文献[3]. PCR 产物纯化按厂家说明书.

1.3 　PCR扩增
扩增纳豆激酶基因引物 1:5’GCGGATCCAT2GAGAAGCAAAAAATT3’,引物 2: 5’CCCTC2GAGTTGTGCAGCTGCTTG3’,其中引物 1 引入起始密码子 ATG和 BamH Ⅰ酶切位点 ,引物 2 引入 XhoⅠ酶切位点. 以纳豆杆菌基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增 ,扩增条件为 94 ℃2 min 预变性后 ,94 ℃45 s、50 ℃1 min、72 ℃1 min 共 30 个循环 ,{zh1}一轮循环后在 72 ℃延伸 10 min.

1.4 　重组表达载体的构建PCR 产物经过 PCR 产物纯化试剂盒纯化后 ,用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切 ,连接到同样经过+BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切的 pET28a 载体上 ,转化 ,涂布到含卡那霉素的固体培养基上 ,挑取单菌落培养 ,抽提质粒 ,双酶切和 PCR 鉴定.选取重组质粒进行双向测序. 经过鉴定的重组质粒命名为 pET2NK.

1.5 　纳豆激酶在大肠杆菌中表达及纯化( )重组质粒转化到大肠杆菌BL21 DE3 ,挑取单μ菌落 37 ℃培养过夜后 ,取 50 L 接种到含 0.1 %卡那霉素的 5 mL 液体培养基中 ,37 ℃培养 3 h 后加IPTG至 1 mmol/L ,诱导培养 3、4、5、6 h 后取样.+( )以含有pET28a 质粒的BL21 DE3 菌株同样处理作对照.取1.5 mL 诱导后的菌液,4 ℃6 000 r/ minμ离心 5 min ,取沉淀用 100 L PBS 溶液悬浮 ,加入μ100 L 上样缓冲液 ,沸水浴 10 min ,12 000 r/ min离心 5 min ,取上清,12 %的 SDS2PAGE 鉴定.电泳结束后用考马斯亮蓝染色,脱色观察有无目的条带出现. 将大量诱导表达的菌体用超声波破碎后 ,12 000 r/ min离心 5 min,取上清,在 Akta explorerTM100快速纯化系统用 HiTrap Chelating HP柱纯化.

1.6 　兔抗纳豆激酶的多克隆抗体的制备与鉴定取1 mL 纯化的纳豆激酶与 1 mL 弗氏xx佐剂等体积混合 ,研磨乳化 ,皮下多点注射免疫家兔.于第20 d和30 d 加强免疫两次 ,第三次免疫后10 d心脏采血,离心制备血清 ,用 ELISA 和 Westernblotting 检测抗体滴度和免疫反应性.

1.7 　表达产物溶纤活性分析参照 Astrup[4]的方法 ,取 5 mL 10 mg/ mL 牛血纤维蛋白原 ,加入 5 m L 冷却至 50 ℃左右的 2 %μ琼脂糖溶液、10 L 牛血纤溶酶原储备液和 10 U 凝血酶后混匀 ,倒入 8 cm 培养皿中 ,4 ℃放置 30 min后打孔备用.分别取纯化的重组纳豆激酶融合蛋白μ5、10、15 L 加样于制备好的纤维蛋白原平板中 ,另+以 5U 尿激酶和诱导的含pET28a 质粒BL21 菌液超声波破碎液上清作为对照 , 在湿盒中 37 ℃培养

2 　结果与分析
2.1 　pETNK重组质粒鉴定
由于在纳豆激酶基因 5’端和 3’端分别引入BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位点 ,重组质粒 pETNK用BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切、PCR 扩增鉴定 ,结果与预期的一致 ,在1100 bp 左右有一条特异的DNA 片断.由此可以确定纳豆激酶基因已经成功插入大肠+( )杆菌表达载体pET28a 中 见图 1 .重组质粒双向测序结果表明 ,本文克隆的纳豆激酶基因序列与文献[2]报道的同源性为 99 %.图 1 　重组质粒pETNK鉴定Fig. 1 　Identification of recombined expression plas2mid pETNKλ1 —DNA EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ酶切; 2 —重组质粒pETNK BamH Ⅰ+ Xho Ⅰ双酶切; 3 —载体pET28a BamH Ⅰ+ Xho Ⅰ双酶切; 4 —重组质粒pETNK PCR 扩增产物λ1 —DNA EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲdigested; 2 —pETNK BamH Ⅰ+ XhoⅠdigested; 3 —pET28a BamH Ⅰ+ Xho Ⅰdigested; 4 —Amplifiedfragment with pETNK by PCR

2.2 　纳豆激酶的表达及纯化
重组质粒转化到大肠杆菌 BL21 DE3 ,IPTG诱导表达后 ,离心收集菌体 ,菌体超声波破碎后 ,SDS2PAGE结果显示在 31 kD 附近有一条特异条带.且表达产物存在于超声波破碎液上清中.含重组( )质粒pETNK大肠杆菌 BL21 DE3 大量诱导培养后 ,冰浴超声波破碎菌体 ,离心取上清经亲和层析柱纯化.结果如图 2 所示.图 2 　表达的纳豆激酶 SDS2PAGE图Fig.2 　SDS2PAGE of expressed NK+M —蛋白质分子量标准; 1 —诱导的含质粒 pET28a 的BL21 菌体总蛋白; 2～5 —IPTG 诱导 3、4、5、6 h 的含重组质粒 pETNK 的BL21 菌体总蛋白;“———”为目的条带M —protein molecular weight marker; 1 —induced product of+( ) ( )pET28a DE3 ; 2～5 —pETNK DE3 induced 3 ,4 ,5 ,6 hours byIPTG;“———”: target band

2.3 　抗纳豆激酶多克隆抗体的制备与鉴定
以纯化后的重组纳豆激酶融合蛋白为抗原 ,分别以 1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000 和1 ∶16 000 稀释抗体 ,ELISA 间接法测得抗体滴度约为1 ∶8 000.将制备的多克隆抗体以 1 ∶2 000 稀释后进行 Western blotting 实验 ,结果证实纳豆激酶纯化产物在 31 kD 附近有一条特异的带出现. 如图 3所示.
图 3 　纯化产物 western blottingFig. 3 　Identification of the expressed NK poly2clonal antibody by western blottinga —亲和纯化产物;b —纯化产物 western blotting结果TM
a —recombinant nattokinasefusion protein purified by Hitrap ; b —the result of western blotting

2.4 　表达产物的溶纤活性分析μ纯化的重组纳豆激酶融合蛋白 5、10、15 L 分别加样于制备好的纤维蛋白原平板中 ,纤维蛋白平板在 37 ℃的湿盒中温育后 ,有明显的溶圈产生.含+pET28a 质粒BL21 菌液超声波破碎液上清则未见溶圈出现.结果如图 4 所示.图 4 　纤维蛋白平板检测纯化产物溶纤活性Fig.4 　Fibrin plate assay of purified recombi2nant Nattokinase fusion protein+1 —含pET28a 质粒BL21 菌液超声波破碎液上清; 2～4 —5、10、μ15 L 纯化产3 ∶5 U 尿激酶μ1 —negative control; 2～4 —5、10、15 L purified recombinant Nat2tokinase fusion protein 3 ∶5 U urokinase3

　讨　论
1987 年须见洋行首次报道在日本传统食品纳豆中存在一种有强纤溶活性的纤溶酶 ———纳豆激酶 .纳豆激酶在体内外都有明显的纤溶活性.在对鼠的十二指肠给药纳豆激酶实验中 ,发现纳豆激酶[6]可以被鼠消化道吸收 ,并在鼠体内产生溶栓效果 .人体实验显示 NK可提高血浆优球蛋白的纤溶活性 ,同时能使血浆中的纤溶酶原xx剂的水平提[7～9]高 .近年来 ,国内有学者利用基因工程生产重组[10]纳豆激酶.张淑梅等 在大肠杆菌中表达了纳豆激[11] [12]酶成熟肽基因;刘北域 、谢秋玲等 在大肠杆菌中表达了纳豆激酶原基因 ,并得到经过自身剪切和未剪切的两种表达产物 ,经过自身剪切的表达产物[13]具有纤溶活性.刘北域等 在枯草杆菌中表达了包括启动子、信号肽、成熟肽和 3’端非编码区的全长纳豆激酶基因.在笔者的前期实验中发现 ,单表达纳豆激酶成熟肽基因的表达产物溶纤活性不高 ,原因可能是纳豆激酶前导肽对纳豆激酶形成有活性的构[14 ,15]象具有重要作用 .在本研究中作者克隆了包括启动子、信号肽、成熟肽序列的纳豆激酶全长基因 ,并在大肠杆菌中成功地表达 ,表达的纳豆激酶融合蛋白大小约为 31 kD. 表达产物经过纯化后制备了抗纳豆激酶多克隆抗体 ,为纳豆激酶作为保健食品的开发打下了基础 ,同时也为 ELISA 法检测食品药品中纳豆激酶创造了条件.