.9.4 国外肉品发酵剂的研究动态
     目前所使用的发酵剂的筛选是根据微生物的环境适应性和加工特性的要求，因此，我们对微生物了解越多，就越能更好的生产出优良的发酵剂。未来发酵剂的研究将集中在提高乳酸的转化率，提供良好的风味组分，产生抗氧化剂和微生物抑制剂等功能性物质上。通过诱变筛选理想的酵剂要耗费大量的时间，并不能获得有些菌株所不具备的新的遗传特性。另一方面，可以利用 基因工程手段将存在于其他微生物中有利于发酵肉制品性状转移到发酵微生物中。运用基因工程技术对肉品发酵剂的改造主要集中在以下几个方面：①增进对发酵微生物遗传特性的了解；②对发酵微生物自然特性的遗传修饰和表达调控；③基因工程菌的构建。虽然基因工程技术和基因工程菌主要在奶制品工业中应用，但在发酵肉制品中应用的有些微生物的基因工程正在日益受到人们的重视。
     发酵肉制品发酵剂的基因工程主要集中在乳酸菌。目前，已将半乳糖苷酶基因、过氧化氢酶基因和xx素基因克隆到相关的乳酸菌中。例如，来自于葡萄球菌的溶葡萄球菌素基因转移到肉品发酵剂的乳酸菌中，在发酵肉制品的加工过程中可抑制金黄色葡萄球菌的生长，从而提高了产品的卫生品质。
     展望乳酸菌发酵剂在肉品加工中的应用，除基因工程技术的运用外，还有几个崭新的领域为发酵剂的开发和应用提供了方法和途径。如保藏发酵剂的开发；副产品的综合利用；产品卫生质量的改善；食物病原菌传播途径的有效阻隔等。这将激发发酵剂在世界范围内更广泛的应用。
     我国对肉品发酵剂的基础研究几乎还是空白，已有的工业化发酵剂都依赖于进口，没有自主知识产权，也不能开发出符合我国人民生活习惯的产品。近几年来，南京农业大学江汉湖、李宗军等人对我国传统的具有民族特色的发酵肉制品的微生态进行了系统的研究，为乳酸菌发酵剂的开发及其在肉制品中的应用打下了坚实的基础，为具有中国特色的发酵肉制品的生产提供了可能.
8.10 微生物与工业发酵
8.10.1 乙醇发酵
8.10.1.1 概述
     乙醇被广泛地应用于国民经济的许多部门。在食品工业中，它是配制各酒类制品、食醋及食用香料的主要原料；在化学工业中，它是不可缺少的基础原料和溶剂。利用乙醇可以制造聚氯乙烯、乙二醇、聚苯乙烯、冰醋酸、苯胺、酯类、乙醚、环氧乙烷等大量化工产品。在医xx面，它用来配制和提取医药制剂，并作为消毒剂；在能源工业中，随着环保意识的增强，乙醇{zd0}的用途是全部或部分作为汽油代用品，以避免或减轻汽油燃料废气对空气的污染。
     历史上工业化乙醇生产是在19世纪末发展起来的，到20世纪40年代，发酵法生产达到了高峰。我国现代化乙醇工业始自1907年。50年代乙醇工业逐步发展起来，近年来高温α-淀粉酶、高糖化力糖化酶、耐高温酵母、活性干酵母、差压蒸馏及各种酒糟处理新技术得以应用，并引进了一些乙醇联产饲料的成套设备和技术，使我国乙醇生产再上一个台阶。当今我国乙醇行业面临的{zd0}课题是原料、成本和污染三个问题。解决发酵乙醇原料的根本出路，在于利用纤维原料代替粮食；乙醇生产与饲料生产相结合，饲料粮先酿酒，酒糟再生产蛋白质饲料。节能应放在原料粉碎、蒸煮、蒸馏等工序的技术革新和改造上。利用基因工程技术构建能直接发酵生淀粉、纤维素、半纤维素的菌株，以及耐高温酵母、抗杂菌乙醇发酵菌等的获得都将从根本上改变目前乙醇生产面貌。
8.10.1.2 发酵菌种
     用微生物发酵乙醇主要是用酵母菌，而且大部分是用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)制造乙醇。在某些条件下有时也用其他的一些种，例如S．anamensis及粟酒裂殖酵母，以便由含糖的基质中以工业的规模制造乙醇；如用乳脂酵母(Torula cremoris)，由乳清为原料发酵生 产乙醇。乙醇发酵要求菌种有较高的发酵能力、生长速率和耐乙醇能力，既对本身代谢产物的稳定性高因而可进行浓醪发酵。常用菌种还有拉斯2号(Rasse2)、K字酵母、南阳混合酵母 （ 1308)、卡尔斯伯酵母、耐高温WVHY8酵母、呼吸缺陷型突株Sb724酵母、浓醪(耐16％乙醇)粟酒裂殖酵母等。酒母培养与发酵工艺流程如下：原菌斜面活化→液体三角瓶培养→卡氏罐→小酒母→大酒母。培养温度28～30℃，卡氏罐前培养基可用米曲汁，小酒母后用生产醪培养，大、小酒母培养有间歇式、半连续式和连续式。酒母用量为发酵液的10％。近年来生产厂家多采用酒用活性干酵母。
8.10.1.3 乙醇发酵生产工艺
     按照基质的不同，制造乙醇方法也不同。可分为淀粉质原料、糖质原料和纤维质原料三大类。淀粉质原料酒精生产工艺的一般流程是：淀粉质原料首先加水进行预处理，接着经过蒸煮，并加入糖化剂进行糖化后，接入酒精酵母进行发酵，发酵产物经过蒸馏以获得成品酒精、杂醇油和醛脂馏分；对于糖质原料的酒精生产工艺一般流程是：在糖蜜中加入水、酸、营养剂和防腐剂进行预处理后以获得稀糖液(此过程也叫稀糖液制备)，然后在稀糖液中接入酒精酵母进行发酵，发酵产物同样经过蒸馏以获得成品酒精、杂醇油和醛脂馏分；纤维质原料的酒精生产工艺流程则是：纤维质原料首先通过预处理，再加入酶或酸进行水解，获得的水解液经过处理后，再接入酒精酵母进行发酵，并经过蒸馏以获得成品酒精。
     (1)含糖基质的乙醇发酵。由甘蔗糖或甜菜制糖时所留存的残渣、甜菜、糖蜜、水果及果实汁液，另外还有乳清，这些基质一般不糖化就能应用。糖溶液或糖蜜在发酵前稀释到10％～18％的糖含量，按照分析结果向糖蜜中添加氮及磷源，即硫酸铵、磷酸铵或酵母提取液。加入少量的高级醇(C₆–C₁₀)能使乙醇的产量提高。紧接着将溶液调pH到4～4.5，然后接种酵母。
     酵母用常用的传种方法制备，即由试管培养物到大瓶，其基质量递增。酵母菌液接种量应为发酵罐体积的4％～6％。接种溶液的制备也能用一种酵母纯培养器进行。在这种系统中，通气的条件下，酵母培养物作二步或三步的繁殖，然后用以接种发酵罐。这个设备是在一个增殖槽中继续不断的培养一定量的接种酵母，可由其中取出一定量的为接种所用。酵母在增殖槽内的残余则由另一个无菌的容器注满无菌营养液，而酵母菌株又再度繁殖。通过这种程序便总有足够的酵母以接种定量的待用发酵液。在很多企业中将发酵结束后离心出来的酵母(只要它被杂菌污染不多时)用为新的一批再度接种之用。
     发酵罐的容积通过适当的措施，例如用叶轮，通过向基质内吹入压缩的空气泡，或由于桶内的分散板(Staubleche)可使酵母与待用发酵液良好混合。在{dy}阶段酵母呼吸氧气而繁殖。第二阶段，即两天以后隔绝空气乙醇发酵开始了。发酵过的醪液立即蒸馏，所得的乙醇通过分馏使之与存在的杂醇油分开。乙醇之产量约为可发酵的糖的90％。
     (2)含淀粉基质的乙醇发酵。所有的谷物类(特别是黑麦、大麦、小麦、燕麦，及小米、玉米、稻米)、马铃薯、甜菜渣、甘薯及别的含淀粉物质，这些基质在发酵前必须先用麦芽或霉菌淀粉酶进行糖化。
     基质原料处理：包括除杂、粉碎和蒸煮等工序。原料中的杂质有泥沙、石块、纤维质及金属等，用气流一筛式分离机和磁力除铁器除去杂质；粉碎和湿粉碎，用锤式粉碎机，二级粉碎，控制粉碎比，粗碎比为l：10～15，细碎比1：30～40。原料输送有机械式和气流式；整粒原料蒸煮温度145～155℃，外加吹醪时的压力差和蒸汽的绝热膨胀，才能得到均一的醪液。粉碎原料温度要控制在130C。高温高压蒸煮工艺有间歇式和连续式。间歇式即粉料与水以1：3～4的比例混合，预热55～65℃，蒸煮压力(2.5～3.5)×10⁵Pa，60min左右。连续式又有罐式、管道式和塔式连续蒸煮，可缩短蒸煮时间。近年来无蒸煮工艺，即生淀粉(生料)发酵和低温蒸煮工艺，即80～85℃下加热液化得以应用。生料发酵指粉状原料加水，加糖化酶，辅加果胶酶、纤维素酶等复合酶系，不需加热，使淀粉糊化和液化。低温蒸煮工艺指100℃以下，另加α–淀粉酶作液化剂的工艺，有两种形式：90～95℃糊化工艺和80～85℃糊化液化工艺。
     制醪过程：谷物淀粉的软化系在硫酸的作用之下分解谷粒，并能加强淀粉酶的活性。lOOkg的淀粉加入约10kg粉碎的大麦芽；若用霉菌淀粉酶时，则lOOkg的淀粉用6～8kg，它们都是用水拌匀。糖化在制醪器中进行，它装备有搅拌器，加热及冷却设备。{zj0}糖化温度接近55℃。 在这个温度时淀粉酶的活性{zg}，以便尽可能的将淀粉转化成糖。
     发酵过程：在发酵时采用粉末状酵母(主醪液量的5％～10％)，它应当以细腻分散态存在于整个的培养基质中。酵母菌必须是上面型酵母，以便当发酵时尽可能久地保持悬浮态。因此，发酵过程始终是强烈的。在啤酒发酵中要持续7～lOd，而乙醇发酵中只需72h。在向醪液加入酵母以前，必须将糖化的醪液中所存在的微生物杀死，或防止其生长。因此人们用乳酸进行酸化。乙醇发酵分为三个阶段：①前发酵阶段。在此时酵母的量适度地生长。温度上升，但不应超过24～25℃。②主发酵阶段。在开始时，发酵了糖量的45％～50％。酵母增殖变缓。在约30h之后，温度可能达到约27.5℃(它是最适温度的上限)。③后发酵阶段。酵母菌主要利用尚未糖化的糊精进行发酵，换言之，由于淀粉酶的活动，由糊精中产生麦芽糖，并立即发酵。当进行发酵时总存在着xx污染的危险。在淀粉质原料中最常用的是玉米和薯干，其可发酵性物质是淀粉，而酵母不能直接利用和发酵淀粉为乙醇，因此淀粉原料生产乙醇要经过原料粉碎，以破坏植物细胞组织，便于淀粉的游离。采用蒸煮处理，使淀粉糊化、液化，并破坏细胞，形成均一的醪液， 使其更好地接受酶的作用，并转化为可发酵性糖后才能被发酵。发酵工艺有间歇式、半间歇式和半连续式和连续式发酵。成熟醪乙醇含量10％左右。
     随着酶制剂工业发展，现乙醇发酵生产用糖化剂均采用淀粉酶和糖化酶。糖化工艺有间歇糖化、连续糖化和双液流糖化工艺。蒸煮糖化醪采用真空冷却或混合冷却等降温至60℃加入糖化剂，保温30min。糖化剂用量：固体曲是原料重量的2％～5％，液体曲是糖化醪量的10％～20％，糖化酶用量是100～150μg^-1淀粉。近年来高强度乙醇发酵、细胞回用发酵、塔式发酵、透析膜发酵、固定化细胞发酵、萃取发酵、真空发酵、膜回收乙醇发酵、中空纤维发酵、固体发酵等新技术均取得很大研究进展。
8.10.1.4 蒸馏
     全世界从发酵醪中回收乙醇均采用蒸馏的方法，经典的乙醇蒸馏工艺是采用两塔或三塔式蒸馏。近年来，为了节省能耗，各种类型的节能蒸馏如差压蒸馏和热泵蒸馏等和非蒸馏法回收乙醇，如选择性吸附乙醇回收法、溶剂萃取回收乙醇法等方法不断出现，仅少数用于大生产，但已展示出美好的前景。
8.10.2柠檬酸发酵
8.10.2.1 概述
     柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量较多。柠檬酸(Citric acid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸(2-hydroxpropane-1，2，3-tricarboxylic acid)。柠檬酸是食品、医药、化工等领域应用最广泛的有机酸之一。它是五色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，无臭，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍后有涩味。在温暖空气中渐渐风化，在潮湿空气中微有潮解性。
     柠檬酸是发酵法生产的最重要的有机酸。它在水中溶解度极高，能被生物体直接吸收代谢。它的许多特殊优点使它得到了广泛的应用。它本身也是化学合成的中间体，成为化学合成的基础原料。柠檬酸的{zd1}呈酸味浓度即舌味蕾感到酸味时的浓度又称为柠檬酸的阈值为0.0019％，它是应用极广的廉价的有机酸。它的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。随着技术的进步，柠檬酸的应用新领域也在不断地被开拓。自1938年金培松从四川柑橘中分离出产酸较高的黑曲霉2087后，科学工作者先后对产生菌的产酸能力、C⁶⁰γ–射线和氮芥等化学诱变处理及发酵原料进行了深入的研究。先后进行了浅盘、深层和石油发酵生产柠檬酸的研究。生产方法和工艺手段都有了长足的进步。C_10～22的链烷烃和植物加工及工业废液也成为柠檬酸生产的有效原料。
8.10.2.2 柠檬酸发酵菌种
     (1)生产菌种。柠檬酸发酵可利用的微生物很多，例如黑曲霉(Asp．niger)、文氏曲霉(Asp.wentii)、泡盛曲霉(Asp．awamoti)、芬曲霉(Asp.fenicis)、二歧拟青霉(Paecilomycesdivaricatum)、丁烯二酸曲霉(Asp．fumarieus)、斋藤曲霉(Asp．saitoi)、宇佐美曲霉(Asp．usamii)、淡黄青霉(Penicillium luteun)、橘青霉(P．crtrinum)、棒曲霉(Asp．clavatus)及梨形毛霉(Mucor Piriforms)。还有普通黑粉菌(Ustulinavulgaris)、绿色木霉(Trichlderma viride)及假丝酵母属中的一些种。柠檬酸主要采用发酵法生产。其中，最广泛采用的是黑曲霉(Asp．niger)、文氏曲霉(Asp．wentii)和解脂假丝酵母等菌种的液体深层 发酵法。柠檬酸发酵中最常用的糖源是淀粉原料，其柠檬酸产量{zg}。其他多样化的碳源，如烷
烃和废糖蜜也可用于发酵生产柠檬酸。黑曲霉的形态特征见表9-15。
     (2)菌种扩大培养。菌种的扩大培养从少量的微生物原种开始，经过数代繁殖培养，为规模发酵提供相当数量的健壮的菌种培养物。发酵生产柠檬酸的菌种扩大培养采用的工艺为：原种→斜面培养→三角瓶麸曲培养→种子罐培养→发酵罐发酵。
8.10.2.3 柠檬酸发酵工艺
     柠檬酸发酵不论采用何种微生物都是典型的好氧发酵。工业上好氧发酵的方法有三种：浅盘发酵、固态发酵和液体深层发酵。前两种方法利用气相中的氧，后者利用液相溶解氧。另外对柠檬酸的(半)连续发酵、固定化细胞发酵、酵母菌和xx发酵等都有所研究，但从经济成本考虑，液体深层发酵{zj1}竞争力，而浅盘培养和固态发酵作为有益补充依然存在。
     (1)浅盘发酵法。浅盘发酵是利用生长在液态培养基表面的微生物的代谢作用，将可发酵性原料转化为柠檬酸。主要用于糖蜜原料。糖蜜加等体积沸水，搅拌煮沸15～30min，加硫酸或碳酸钠调pH至6.8～7.2，糖蜜浓度12％～16％(以蔗糖计)，冷却至60～70℃时加入营养盐溶液和xx剂，在45～50℃时入发酵室装盘，液层深8～20cm，冷至35℃时接种黑曲霉干孢子(2～2.3×10⁹个·g^-1)。接种后，35℃维持3d，促进孢子发芽。菌体发育之后进入产酸阶段，温度控制26～28℃，{zd0}风量15～18m³/(m²·h)，风温25℃以下，湿度75％以上，总发酵时间8～9d。产柠檬酸最适合pH2.5以下，采用黄血盐处理(1L培养液加0.1％黄血盐溶液3.5ml)。该方法具有设备简单，投资少，投产快；操作技术简单，能耗低；原料粗放，产酸浓度高等优点。但也有占地面积大，劳动强度高，发酵时间长，菌体生成量影响产酸率等缺点。
     (2)固体发酵法。固体发酵法也属浅盘发酵法的一种，是将发酵原料及菌体被吸附在疏松的固体支持物(载体)上，经过微生物的代谢活动，将原料中的可发酵成分转化为柠檬酸。此法虽较落后，但可利用薯渣，进行发酵，发酵后的残渣仍可作为饲料，因为此法具有一些优点，故有存在的价值。淀粉渣的干淀粉含量50％以上。通过筛选获得一株适于淀粉渣固体发酵用的黑曲霉。在培养90h后，可得到含水分50％、柠檬酸6.65％的麦曲。为了提高淀粉渣的柠檬酸产率，可以添加谷氨酸发酵残渣作为辅料进行培养，提高生产率。通常固体曲生产柠檬酸时，常因品温高达30～40℃，以致造成青霉及其他杂菌污染，而使柠檬酸产率下降。如果品温保持27～28℃，青霉的繁殖可被抑制，有利产酸。
     (3)深层发酵法。深层发酵法其优点是发酵体系为均一的液体，传热质良好；设备占地小，规模大；发酵速度快，时间短；产酸高，原料消耗低等。国内液体发酵罐一般为50～100m³，可发酵蔗糖、淀粉水解糖、糖蜜、薯干粉及精淀粉。以薯干粉为原料发酵生产柠檬酸，一般产量为10.9％～13.8％，转化率可达91％～104％，发酵周期4d。将玉米淀粉用酸法或酶法转变为糖后，再进行柠檬酸发酵。酸法一般是用盐酸进行淀粉的水解，但有一些缺点，例如转化的糖液中含有糊精、龙胆二糖或异麦芽糖等，这些糖是不能发酵的，因此柠檬酸产率就减少了。为克服上述特点，改用双酶(α–淀粉酶和糖化酶)转化法。Miles公司采用粗原料双酶转化法：
     ①将淀粉质原料与水的混合物，如α–淀粉酶后，在71～90.5℃，pH6.5～7.7，作用20min， 使粗原料中的淀粉xx液化。
     ②将液化淀粉溶液冷至62.7～65.5℃。
     ③将上述溶液的pH调节至4.0～5.5。
     ④添加不含蛋白酶、脂肪酶和葡糖苷转移酶的糖化酶制剂。
     ⑤维持上述混合物的温度为54～63℃，历时15～96h，使液化淀粉变为糖。糖的收率为理论收率的88％。
     ⑥上述溶液用磷酸调节pH3.4，再热至88℃后，滤去其中的不溶物质。
     ⑦将所得滤液再加石灰调节pH7后，过滤，用水稀释至含糖20％～21％的溶液，再用硫酸调pH至2.1～2.3。通过强酸性阳离子交换树脂柱，流出液用NH₄OH调节pH至2.8后，再KH₂PO₄0.015％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，Cu^{+ +}0.2μg/kg(以CuS0₄)计，Zn^{+ +}0.2μg/kg)(作为ZnSO4)，Ca^{+ +}50μg/kg(以CaCl₂计)，接种黑曲霉孢子，在30～32℃通气发酵。在发酵期中补加氨与糖液。
     (4)其他发酵实例。发酵原料除了淀粉质原料以外，也有采用废糖蜜、正构石蜡为原料来进行柠檬酸的生产。利用正构石蜡，现常用的假丝酵母如解脂假丝酵母、涎沫假丝酵母(C．albicans)、热带假丝酵母(C．tropicalis)、白假丝酵母(C．albicans)、副热带假丝酵母(C．paratropicalis)等菌株进行发酵生产，以前两株最为常用。其一般培养条件如下：
     ①碳链的长度。奇数、偶数的正构石蜡的柠檬酸产率相同，使用解脂假丝酵母时(C₁₀～C₁₆)或(C₁₂、C₁₄及C₁₆)的正构石蜡适于柠檬酸的生成，而使用涎沫假丝酵母时C₁₆～C₁₈的正构石蜡合适，当使用柠檬假丝酵母(C．citrica)时，则是C₁₂～C的正构石蜡最适于柠檬酸的生成。
     ②氮源浓度。氮源以0.3％～0.4％为最适浓度。
     ③磷酸浓度。磷酸与正烷烃的重量比(P/C)以(0.6～1.0)×10^-3为宜。培养基中磷酸浓度应低于菌的{zd0}生长所需的量。
     ④温度。解脂假丝酵母为26℃，涎沫假丝酵母及柠檬假丝酵母的最适温度为30℃。
     ⑤pH及中和剂。解脂假丝酵母、涎沫假丝酵母、柠檬假丝酵母为pH 5.5～6.5，但在酸性条件下副产多元醇，常用的中和剂有碳酸钙、氨水等。
     ⑥发酵方法改进。菌体的循环使用法：使用解脂假丝酵母进行柠檬酸发酵时，由发酵液分离出的菌体，可以直接再循环使用，费用因而下降；二步连续发酵法：此法是将假丝酵母的生长期与产酸期分开，第二级发酵的容量比{dy}级发酵大5～20倍。{dy}级发酵与第二级发酵所用培养基的组分不同。前者要求含有一定量的氮源，以供酵母的生长，而第二级的培养基只含有矿盐，且所含氮源低于酵母生长的需要量。
9。10．2．4 柠檬酸生物合成途径
     黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸，其生物合成途径现普遍认为是葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面二氧化碳固定化反应生成草酰乙酸与CoA缩合生成柠檬酸。这一过程已为许多学者研究证实。黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环和乙醛酸循环。
     在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。由葡萄糖发酵柠檬酸的理想途径，即葡萄糖生成柠檬酸的碳平衡和能量代谢如图9-5。

     由图9-5所示，葡萄糖生成的柠檬酸的全过程中，在碳平衡方面无碳原子的损失，在乙酰CoA和草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子，总反应为：                 

    可见柠檬酸发酵对糖的理论转化率为106.7％，以一个结晶水的柠檬酸计为116.7％。在能量平衡方面，EMP途径中，由底物水平磷酸化产生2ATP，由氧化磷酸化可产生9个ATP，但黑曲霉中存在有别于正常呼吸链的侧呼吸链，不产生ATP，实际产生的ATP数少于此数。所生成的ATP可供菌体维持渗透功能等需要，不必再消耗碳源经TCA循环产生能量。
     柠檬酸是中枢代谢途径——TCA循环中一员，是许多组织和微生物中广泛存在的一种重要有机酸。它不仅为许多微生物利用同化，而且是一种重要的代谢调节因子。通常微生物细胞中合成的柠檬酸进一步经TCA循环，生物合成其他有机酸，提供合成细胞物质的中间体或彻底氧化产生能量，为细胞活动和需能合成代谢提供能量。因为正常生长的细胞中柠檬酸是不会过量积累的。
     黑曲霉发酵生产柠檬酸的机理与三羧酸循环有密切关系如图9-6所示。乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素例如金属离子的缺乏或代谢毒物的存在，而受到抑制，这对柠檬酸累积的影响很大。当累积柠檬酸时，相关代谢过程中，各种中间产物的水平与三羧酸循环的酶活力有关。当黑曲霉生长期间几乎全部TCA酸的水平都非常高；而当柠檬酸累积的诱导期间，延胡索酸、异柠檬酸减少，而丙酮酸、草酰乙酸和柠檬酸增加。这种中间物的短暂水平的变化的主要表现是α–酮戊二酸脱氢酶的缺少。因此琥珀酸、延胡索酸的水平等便减少。同时由于酶解作用强烈，所以丙酮酸、草酰乙酸增加，为柠檬酸的累积提供了条件。使用黑曲霉生产柠檬酸的过程中，培养基中的碳与氮逐渐减少，而固形物则逐渐增加；当氮耗尽时，才开始生成柠檬酸，可知培养中氮的耗尽是生产柠檬酸的先决条件。

8.10.2．5 柠檬酸提取
     我国柠檬酸的提取一般采用钙盐法。发酵液经加热处理后，滤去菌体等残渣，加CaCO₃和石灰乳中和，使柠檬酸以钙盐形式沉淀下来，废糖水和可溶性杂质则过滤出去。柠檬酸钙加硫酸酸解，使柠檬酸游离，形成的硫酸钙(石膏渣)被滤去。所得粗柠檬酸经脱色和离子交换净化，除去色素和胶体杂质。净化后的柠檬酸溶液浓缩后结晶出来，离心分离晶体，经干燥和检验后即为成品。
8.10.3 谷氨酸发酵
     谷氨酸在1866年首先被Ritthausen氏发现。它在糖代谢及蛋白代谢过程中占据重要的位置。其单钠盐(α–氨基戊二酸一钠)是常用调味品。目前谷氨酸的生产大都以玉米、大米、木薯等粮食为原料，用发酵法制取，原有的水解提取法和合成法已停用。
8.10.3.1 谷氨酸发酵菌种
     目前国内各谷氨酸厂所使用谷氨酸产生菌主要有天津短杆菌(Brevibacteriaceae Tianjianense)T_6-13及其诱变株FM8209、FM-415、CMTC6282、TG863、TG866、S9114、D85等菌株；钝齿棒杆菌(Corynebacterrum crenatum)ASl 542及其诱变株B₉、B₉-36、F-263等菌株；北京棒杆菌(Corynebacterium Pekinense)ASl299及其诱变株7338、Dll0、WTH-1等菌株。现在多数厂家生产上常用的菌株是T_6-13、FM-415、S9114、CMTC6282等。
     短杆菌属(Brevibacterium)的主要特征是细胞为短的不分枝的直杆菌，(0.5～lμm×l～5μm)。革兰氏染色阳性。大多数不运动，运动的种具有周生鞭毛和端生鞭毛。在普通肉汁蛋白胨培养基中生长良好。多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖。有时产非水溶性色素。色素呈红、橙红、黄、褐色。大多数液化明胶和还原石蕊并胨化牛奶，极少数能使牛奶变酸。可以从乳制品、水、土壤、昆虫、鱼及植物体等样品中分离得到。此外，短杆菌属还不明显地从碳水化合物中产生乳酸、丙酸、丁酸或乙醇。接触酶阳性。菌体形态较规则，非抗酸性菌，除分裂时菌体内形成隔壁外，菌体细胞不具有隔壁。
     棒状杆菌属(Corynebacterium)的主要特征是细胞为直到微弯的杆菌，常呈一端膨大的棒状，折断分裂形成“八”字形排列或栅状排列。不运动，少数植物致病菌能运动。革兰氏染色阳性，但常有呈阴性反应者。菌体内常着色不均一，常有横条纹或串珠状颗粒。胞壁染色表明，菌体由多细胞组成。抗酸染色阴性。好氧或厌氧。从葡萄糖发酵产酸，少数从乳糖发酵产酸。
     现代发酵工业生产规模越来越大，发酵罐的容量有数十立方米，甚至数百立方米。要使微生物在数十小时的较短时间内完成如此规模的发酵过程，那就必须具备相当数量的微生物细胞群体才行。菌种的扩大培养就是要为规模发酵提供相当数量的代谢旺盛的种子。谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子扩大培养的流程，即：斜面培养→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐。
8.10.3.2 谷氨酸发酵工艺
     (1)生产原料。谷氨酸的生产以淀粉质为主要原料，采用发酵法进行生产的工艺。
     ①碳源(淀粉)。淀粉原料是白色无定形结晶粉末，存在于各种植物组织中，颗粒具有一定的形态和层次分明的构造，在显微镜下观察的颗粒是透明的。
     ②氮源。氮是构成菌体蛋白质、核酸及合成谷氨酸的主要元素。谷氨酸生产使用的氮源主要是无机氮及有机氮，如尿素、氨水、碳酸铵等。在发酵中，一部分氮还起到调节发酵液pH的作用，使谷氨酸发酵能正常进行。
     ③辅助原料。在谷氨酸生产过程中，所需的辅助原料主要有工业盐酸：在谷氨酸提取时，加入盐酸，调节pH，使其达到谷氨酸等电点，从而将谷氨酸从发酵液中分离出来；烧碱：化学名为氢氧化钠，用离子交换法提取谷氨酸时，用氢氧化钠溶液洗脱。纯碱，分子式Na₂CO₃，用于中和反应提取谷氨酸钠；硫化钠：分子式Na₂S，主要用于除铁；硫酸镁：一般含有结晶水，其分子式为MgS0₄·7H₂0，谷氨酸发酵培养基中使用硫酸镁，用量一般为0.025％～0.1％。
     ④酶制剂。在酶法水解淀粉工艺中，使用α–淀粉酶(EC3.2.1.1)糖化酶(EC3.2.1.3)作催化剂。
     (2)生产工艺流程。谷氨酸生产流程可分为4个部分：①淀粉水解糖的制取；②谷氨酸生产种子的扩大培养；③谷氨酸发酵；④谷氨酸的提取分离。其发酵过程如图9-7所示。

              
8.10.3.3 谷氨酸的生物合成途径
     谷氨酸的生物合成途径包括糖的酵解(EMP)、己糖磷酸支路(HMP)、三羧酸循环(TCA)、乙醛酸循环、Wood-Werkman反应(二氧化碳的固定作用)等。图9-8是谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸合成途径示意图。
     依据所述合成途径，当葡萄糖转变成谷氨酸时，{zd0}转变效率为1克分子葡萄糖可以生成lmol的谷氨酸，如下式：

                   
     按上式谷氨酸对糖的重量产率为81.7％，但实际上因菌体的生成、微量副产物的生成和生物合成消耗的能量等，消耗了一部分的基质，所以实际的对糖重量产率低于81.7％。

    EMP途径是生物由糖的代谢而生成丙酮酸的途径。隼成的丙酮酸可以通过不同途径，进一步转变为各种不同的产物。葡萄糖除通过EMP途径外，还可以通过HMP途径生成戊糖-5-磷酸，再通过戊糖代谢而分解为二碳化合物和三碳化合物。三碳化合物是与EMP途径相联系的化合物，而二碳化合物再进入三羧酸循环中。1959年由黄色短杆菌(Brevibacterium flavrum)No.2247发现与EMP有关的各种酶的活性如己糖激酶、己糖磷酸异构酶、己糖磷酸激酶、醛缩酶以及连接NADP的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和连接NADP的葡萄糖–6–磷酸脱氢酶，证明此菌的葡萄糖代谢，也包括EMP及HMP两种途径。当谷氨酸发酵时，糖的降解分为两个阶段，{dy}阶段即EMP途径，生成的丙酮酸可被NADH₂还原成乳酸(或酒精)，第二阶段是在有氧存在的情
况下，因NADH₂被分子氧氧化，丙酮酸即不被还原，而是经过氧化脱羧作用变成乙酰辅酶A后，进入三羧酸循环。
     谷氨酸产生菌的α-酮戊二酸脱氢酶活力低，尤其当生物素缺乏条件下，TCA循环到生成α–酮戊二酸时，即受到阻挡。当NH⁺的存在下，α–酮戊二酸因谷氨酸氢酶的作用，转变为谷氨酸。
     谷氨酸发酵与三羧酸循环的关系研究表明，柠檬酸、顺-乌头酸和异柠檬酸，在NH⁺₄存在下，可变为谷氨酸，因此谷氨酸生成是与三羧酸循环有关的。这些三羧酸在无氧时谷氨酸的产率为81％～91％(mo1)，而在有氧时约为50％(mo1)；但用α–酮戊二酸，无氧时其产率仅为9％，有氧时仅有微量。这是由于三羧酸本身可作为供氢体，因此被氧化为α–酮戊二酸后，进行耦联反应，使α–酮戊二酸继续受到还原，而成为谷氨酸。至于α-酮戊二酸本身则不是供氢体，因此当NH⁺₄存在时，还原作用受到阻碍，无法合成谷氨酸，如果增加供氢体如葡萄糖等，则可提高谷氨酸的产率。
     此外，以柠檬酸为基质，添加细胞匀浆作无氧及有氧培养。其结果在无氧反应时，如无铵盐的存在，则产生物中有多量琥珀酸，少量谷氨酸。当三羧酸循环时，葡萄糖氧化而成柠檬酸，而后者氧化成α-酮戊二酸。沿着由柠檬酸至α–酮戊二酸的氧化途径，此菌有两种NADP专一性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L–谷氨酸脱氢酶。当铵盐存在时，两者密切偶联：谷氨酸产生菌需要氧化型NADP，以供异柠檬酸的氧化作用。此NADP因α-酮戊二酸的还原氨基化而再生。谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶活力较强，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧化中间物就不再继续氧化，而经α–酮戊二酸还原氨化生成谷氨酸。
     自1970年在一些xx出现依赖NADP的谷氨酸合成酶(Glutamate synthase)后，谷氨酸脱酶不再是谷氨酸生物合成的惟一途径了。对谷氨酸棒状杆菌的研究表明，当铵离子浓度低时，谷氨酸是依赖NADP的谷氨酸合成酶来合成的，而当铵离子浓度无限量时，则是用依赖于NADP的谷氨酸脱氢酶来合成的。
     当谷氨酸生物合成时，乙醛酸循环居显著地位。乙酰辅酶A与草酰乙酸相互作用，生成柠檬酸，柠檬酸再变成异柠檬酸。异柠檬酸的转化分为两路：一路是生成乙醛酸及琥珀酸，就是乙醛酸循环；一路是生成α–酮戊二酸，就是三羧酸循环。1961年研究扩展短杆菌产生谷氨酸的合成途径，证明在无细胞抽出液中，含有异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。异柠檬酸裂解酶的作用是介于异柠檬酸脱氢酶和乙醛酸还原酶的偶联作用之中。上述耦联反应当培养基中生物素浓度减少时变弱。
     在谷氨酸发酵中有下列两个二氧化碳固定反应。此反应需要NADP。C₄生成后，继之以C₄+C₂→C₆。1960年研究黄色短杆菌NO.2247的二氧化碳固定反应，结果：①在C¹⁴O₂存在的条件下，分别将葡萄糖、醋酸盐、丙酮酸盐、草酰乙酸盐和琥珀酸盐添加黄色短杆菌NO．2247的洗涤过的细胞悬浮液，通气培养后，均可发现有标记的谷氨酸和α–酮戊二酸的生成；②应用此菌的无细胞抽出液，可将C¹⁴O₂的C¹⁴固定入草酰乙酸和苹果酸中。
     在谷氨酸发酵过程中，如生物素过剩则有利于菌体的生长，而不利于谷氨酸的累积，这是xx氧化型；反之如生物素适量，则异柠檬酸酶和琥珀酸的氧化，以及苹果酸和草酰乙酸变为丙酮酸的脱羧作用均呈停滞状态。同时，由于过剩NH⁺₄的存在，因此反应由柠檬酸向谷氨酸的方向进行。
8.10.3.4 谷氨酸提取
     根据谷氨酸和谷氨酸发酵液的性质，其提取方法主要有以下几种：水解等电点法、低温等电点法、低温连续等电点法和离子交换树脂法。为了提高提取收率，有的生产工艺还采用等电―锌盐和等电―离子交换提取等方法。目前提取谷氨酸的新技术有电渗析和反渗透法、浓缩等电点法、离子硅藻土过滤等电法等。其中以离子交换树脂法{zj1}代表性，其流程一般是：首先将等电点母液进行柱交换，再用反洗工艺，接着通过50℃的热水正洗和60℃热碱液洗脱，将洗脱液进行收集，再通过高流分，将流分产物进过等电点法提取以获得谷氨酸。