基于基因芯片的酶反应方法- 液相色谱柱法的日志- 网易博客企业库|免费b2b网站

在ASO的基础上，又衍生出了一些基于基因芯片的酶反应方法，用于SNP的分析。与直接杂交法不同的是，基于酶学方法的基因多态性检测允许探针的3’端或近3’端设计突变碱基。一旦探针的3’端和靶基因序列互补，连接酶和多聚酶能够引导序列的延伸，这种特性可以用来区分不同靶基因的序列。这种方法被称为酶催化的延伸法，主要有引物延伸法和连接酶检测反应。基于这两种方法又发展了其他的基因芯片基因多态性检测手段，这里只介绍上述两种方法。

(1)引物延伸法(primerextension)：引物延伸法中，检测用的引物即探针被共价固定在玻片上，这种方法结合了寡核苷酸芯片的高通量和DNA聚合酶的特异性，典型的芯片引物延伸法的原理与Sanger的双脱氧核苷酸测序法的原理相似，因此这种方法也称为微测序(minisequencing)法。微测序方法的原理是利用DNA聚合酶整合4种标记不同荧光的ddNTPs，酶学延伸将会根据寡核苷酸引物3’端的特定序列延伸特定的ddNTPs，即只延伸一个碱基，且与靶分子互补(图6-2B)。这种方法具有很高的特异性，同时也很敏感，可以区分基因组DNA样本中的纯合子和杂合子。

(2)连接酶法(1igasedetectionreaction，LDR)：连接酶法即连接酶反应单核苷酸多态性分型的芯片方法，该方法的原理是基于连接酶能够区分匹配和非匹配探针末端与标记的报告探针的连接反应(图6-2C)。探针和报告探针之间的连接反应由靶基因引导。在这种方法中，等位基因的SNP位点分别设计在引物(探针)的3’端，两个探针的{wy}区别就是3’端的碱基分别对应不同靶基因的序列，DNA连接酶和荧光报告探针在探针和未标记靶基因的芯片杂交过程中或杂交后加入。该方法{zh0}采用嗜热的DNA连接酶，它结合了区分单碱基变化的高度特异性；同时能在较大的温度范围内保持活性。

amplification，MLPA)：以上两种酶法都是固相反应，而近年来很多芯片酶反应法改为液相反应，这样可以增加反应的面积，如多重连接酶依赖的探针扩增反应就是从LDR发展而来的。在MLPA中，被扩增的不是DNA，而是加到样本中的探针被扩增．和鉴定。MLPA可以用双色荧光系统和单色荧光系统来实现，在双色荧光系统中，每个SNP位点需要两条等位基因特异性探针(allele specif icoligonucleotides，ASO)和一条位置特异性探针(10cus-specific oligonucleotides，LSO)。ASO探针包括两个部分：5’序列为通用PCR引物，分别为P1和P2；3’序列(约20个碱基)同基因组中的SNP位点序列杂交，两条ASO探针3’端

当ASO和LSO与目标基因组DNA配对后，用连接酶连接ASO和LSO，只有能与目标SNP位点xx匹配的ASO探针才能与LSO探针连接上(P1～P3或P2～P3)，连接的寡核苷酸作为PCR的模板，用P1、P2、P3作为引物进行PCR扩增，P1和P2分别标记两种荧光，然后PCR产物与芯片进行杂交。每个SNP一种tag序列，与芯片上对应的互补探针杂交，通过两种荧光信号强度的比值来判断目标样本的基因型。由于引入了连接反应，SNP检测的特异性高。通用引物的引入克服了多个SNP位点检测的多重PCR的困难，而tag的引入可以使用通用芯片，大大降低了芯片的制作成本，并通过优化tag的设计提高了杂交

来源基于基因芯片的酶反应方法

基于基因芯片的酶反应方法, 在ASO的基础上,又衍生出了一些基于基因芯片的酶反应方法,用于SNP的分析。与直接杂交法不同的是,基于酶学方法的基因多态性检测允许探针的...
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