日本资生堂色谱柱-阿奇霉素液相分析方法
阿奇霉素及其制剂

阿奇霉素为2000年版《中国药典》收载品种，制剂有片、胶囊和干混悬剂，其含量测定均采用微生物效价法，操作较为复杂，试验周期长，影响因素多，测定结果为主成分及有xx活性杂质的总和，因而专属性较差。该品种在《欧洲药典》4.6版和USP26版中均采用HPLC法，专属性较强，试验周期短，但均使用的是聚合物极性柱，《欧洲药典》柱温为70℃，USP还使用电化学检测器，这些色谱条件在国内不易普及。为使药品质量真正可控，使方法简便、快速、准确，现经试验摸索出如下色谱条件：采用C8色谱柱，以0.045mol/L磷酸二氢铵-乙腈（6：4，混匀，按0.3%的比例加入三乙胺，使pH值约为7.4）为流动相，检测波长210nm，柱温为40℃。该色谱条件可使阿奇霉素与其有关物质较好的分离，经线性范围考察、重复性试验，溶液稳定性试验、制剂回收率考察、辅料干扰试验等方法学验证，证明其符合定性、定量分析的要求，且简便、快速，适于作为药典方法在国内推广使用。

1. 仪器与试剂、试药
1.1. 仪器 
高效液相色谱仪：日本岛津公司生产 型号LC10A-VP，
美国安捷伦公司生产 型号 HP1100
色谱柱：C8柱 资生堂 SHISEIDO 4.6mm×250mm
智能xx溶出仪：ZRS-8C；ZRS-8G天津大学精密仪器厂生产
水分测定仪：瑞士万通公司生物DM789

1.2. 试剂 
磷酸二氢铵、三乙胺、磷酸氢二钠、盐酸为分析纯；乙腈为色谱纯；胰酶为生化试剂
1.3. 试药 
脱氧苯并红紫阿奇霉素、N-去甲基阿奇霉素
由克罗地亚普利瓦医药工业股份有限公司提供 
阿奇霉素、红霉素 
由中国药品生物制品检定所提供
阿奇霉素及其片、胶囊、干混悬剂  市售药品 

2．原料药含量及有关物质标准修订的方法学试验
色谱条件：
仪器：HP1100液相色谱系统/LC10A/LC2010
色谱柱：C8，5μ，250×4.6mm/150×4.6mm；
流动相：0.045mol/L磷酸二氢铵-乙腈（6：4），按总体积0.3%的比例加入三乙胺，pH值约为7.35
流速：1ml/min
柱温：40℃
检测波长：210nm

2．1．分离度考察
    以流动相为溶剂，分别配制下列溶液：
A. 阿奇霉素粗品溶液。
B. 取阿奇霉素约10mg，加0.1mol/L盐酸溶液1ml，放置5分钟，加流动相稀释至10ml。
C. 取阿奇霉素约10mg，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml，放置5分钟，加流动相稀释至10ml。
D. 1mg/ml的阿奇霉素溶液在80℃放置24小时。
E. 1mg/ml的阿奇霉素溶液在3000Lx光照条件下照射96小时。
F. 1mg/ml的阿奇霉素溶液1ml加过氢化氢试液0.5m，放置1小时。
G. 含阿奇霉素、红霉素、N-去甲基阿奇霉素，脱苯并红紫阿奇霉素各约1mg/ml的混合溶液。 
    取上述溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（见修订说明附图1~7）并考察分离度。结果该色谱系统可将阿奇霉素粗品中的杂质，酸、碱、热、光、氧化条件下的主要降解产物，包括N-去甲基阿奇霉素和脱苯并红紫阿奇霉素、红霉素等已知杂质较好地分离，在上述各图中阿奇霉素峰与相邻峰的分离度均大于2.0，阿奇霉素峰与红霉素峰之间的分离度为3.5以上。表明该色谱系统的专属性良好

2．2.标准曲线及线性范围
    因本品含量测定用供试品溶液浓度约为1mg/ml，进样体积50μl，进样量为50μg，故考察阿奇霉素在约30~80μg范围内进样量与峰面积之间的线性关系。
精密称取阿奇霉素对照品各适量，分别置适宜的量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，使浓度分别为0.6704、0.8192、1.017、1.296、1.414、1.561mg/ml的溶液，各精密量取50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量对峰面积（见下表）做图（见修订说明附图8）并计算线性方程。
进样量（μg） 33.52 40.96 50.85 64.80 70.70 78.05
峰面积×105 6.991 8.587 10.76 14.30 15.65 17.34
线性方程：C=4.251×10-5A+4.314，  r=0.9997
表明阿奇霉素进样量在33.52~78.05μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2．3.方法的重复性
2.3.1精密度考察
    取上述浓度约为1mg/ml的阿奇霉素对照品溶液1份，连续6次进样测定，记录峰面积并计算相对标准偏差（见下表）。
样品 1 2 3 4 5 6
峰面积 1618 1622 1627 1633 1631 1636
RSD 0.42%
结果RSD为0.42%，表明测定方法的精密度良好。


2.3.2重现性考察
取同一批号的样品，按上述方法平行制备6份供试品溶液，进行测定（见下表）。
样品 1 2 3 4 5 6
峰面积/单位重量 64.31 64.86 64.21 64.44 64.79 64.38
RSD 0.41%
结果RSD为0.41%，表明方法的重复性良好。

2.4.溶液的稳定性考察
   取浓度为2mg/ml的阿奇霉素对照品溶液置室温下，每隔1小时进样一次，记录峰面积，持续21小时，数据见下表。
取样时间（小时） 峰面积 与零时峰面积之比
0 591953
1 592517 1.001
2 594069 1.0036
3 591615 0.9994
4 593919 1.0033
5 586735 0.9912
6 586078 0.9901
7 585142 0.9885
8 584257 0.9870
9 585104 0.9884
10 583186 0.9852
11 582763 0.9845
17 589770 0.9963
18 587634 0.9927
19 588567 0.9943
20 584808 0.9879
21 582998 0.9849
结果表明：样品在室温条件下6小时内几乎无变化，至21小时时差异也不大，可满足实验的要求。

2.5.振摇及超声助溶的影响考察
精密称取阿奇霉素原料4份（各约100mg），分别置50ml量瓶中，各加流动相约30ml，分别超声10分钟、20分钟、30分钟及振摇30分钟，放至室温，加流动相稀释至刻度，各进样50μl测定。数据见下表： 
样品 超声10分钟 超声20分钟 超声30分钟 振摇30分钟
峰面积/单位重量 48.77 47.84 48.58 48.79
结果表明：超声10分钟、20分钟、30分钟与振摇30分钟无明显差异。

2.6. {zd1}定量限及检测限的测定
将前述分离度考察溶液G用流动相进行适当的稀释，直至进样所得到的色谱图中阿奇霉素峰的响应值约为基线噪音的3倍和10倍（信噪比为3和10），根据此时溶液中阿奇霉素的浓度得出{zd1}检测限和{zd1}定量检测限，分别为10ng和35ng。表明方法的灵敏度较高。

2.7. 三种已知杂质的峰面积校正因子粗测
精密称取阿奇霉素、红霉素、N-去甲基阿奇霉素和脱苯并红紫阿奇霉素对照品各适量，分别用流动相制成浓度相当的溶液，按上述色谱条件，每份溶液进样3针，分别用单位重量的峰面积平均值之比计算红霉素、N-去甲基阿奇霉素和脱苯并红紫阿奇霉素的峰面积校正因子，数据见下表：
峰面积/单位重量 校正因子
阿奇霉素 480
红霉素 658 0.73
N-去甲基阿奇霉素 389 1.23
脱苯并红紫阿奇霉素 666 0.72
结果红霉素的峰面积校正因子约为0.73，N-去甲基阿奇霉素和脱苯并红紫阿奇霉素的峰面积校正因子分别为1.23和0.72。

2.8．有关物质检测适宜运行时间的考察
取阿奇霉素粗品溶液，按上述色谱条件运行至保留时间的5倍，主要杂质均在阿奇霉素峰保留时间的3倍时间内出峰。又综合参考各种破坏溶液检测图谱，杂质峰也基本集中在阿奇霉素峰保留时间的3倍时间内，故认为将有关物质检测运行时间定为“记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍”较为适宜。 


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