FANG Yu-sen,  YE Jing,  WENG Xue-fen,  et al

Objective To assess the efficiency of inactivated method to manufacture internal quality control serum of hepatitis B type virus surface antigen (HBsAg).

Method The HBsAg positive serum samples with good quality were collected and inactivated by bathing at 60℃ for 1 hour, then mixed and diluted to proper concentration with the reference of control serum provided by the national center for clinical laboratory(NCCL), fractional packed in eppendolf tube and preserved in 2~8℃ refrigerator for assessment detection by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).

Result The target titer value of the self-manufacture control serum was set to 2 IU/ml and 10 IU/ml respectively. Stability of these control serum was confirmed to preserving at 2 to 8 ℃ for 3 months and -20 ℃ for 6 months. Homogeneity test showed that the vail-to-vail imprecision was 5.53%and 8.97% respectively.

Conclusion  These samples could be used as the internal quality control for HBsAg test with ELISA assay.

Key words: Hepatitis B virus surface antigen(HBsAg); 

灭活法研制血清
作者：方裕森, 叶靖, 翁雪芬, 郑宇琼

 目的：用灭活法研制(HBsAg)血清。

方法：筛选HBsAg阳性血清，60℃加热1h进行灭活，同时与卫生部临床检验中心提供的HBsAg质控品比较，选取合适浓度的阳性血清作为ELISA法检测HBsAg的品。

结果：该质控品定值为2 IU/ml和10 IU/ml。其稳定性实验表明：2~8℃3个月及-20℃保存6个月的含量无明显变化。均一性检测结果：瓶间不精密度为7.15%和8.97%。

结论：60℃加热1h灭活法制备的质控品可以作为用于ELISA法检测HBsAg的。

关键词：（HBsAg）；

        乙肝病毒（HBV）的慢性携带者约占我国人群的10%~20%。乙肝病毒可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可转为肝硬化甚至肝细胞癌（HCC），已成为严重的社会和公共卫生问题。目前国内基本上采用ELISA法检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg），但由于缺乏统一标准，国内目前并没有对免疫室内质控标准品-HBsAg的推广及普及，在实际操作中发现不同厂家生产的HBsAg试剂盒敏感性有差别，因而采用不同试剂检测得到的定性结果有较大差别。

        研究制备室内质控品的方法很多，本课题前期研究认为60℃加热1h灭活法{zh0}^［1］。

        为防止结果出现偏差，仅靠商品试剂盒配备的阳性和阴性对照，达不到控制各种因素造成的误差，给HBV感染的临床诊断和xx检测带来了混乱，因此建立室内质控非常重要^［2,3］，自制简便、经济、重复性、稳定性好的HBsAg的医院自用室内质控血清^［4］，提高检验质量，以适应科内日常检验工作者的需要。

        本文将参照卫生部临床检验中心的标准和要求，研制出稳定性符合质控品要求的医院自用室内质控标准品-HBsAg^［5］。

1  资料与方法

1.1  制备阳性血清的筛选

        挑选Anti-HIV、Anti-HCV及RPR均性，无黄疸、无脂血、无溶血、血清标本至少6400ul的HBsAg阳性标本血清60份。其中汕头大学医学院附属肿瘤医院48例，汕头大学医学院{dy}附属医院12例。

1.2  制备

        将HBsAg阳性血清置60℃水浴加热1h进行灭活，灭活后离心吸取上清液备用。

1.3  检测

1.3.1  主要仪器：

        美国StatFax-2100酶标仪，美国StatFax-2600洗板机，IKA WERKE 磁力搅拌仪， METTLER TOLEDO  PH测定仪。主要试剂：上海科华生物工程股份有限公司HBsAg诊断试剂盒，英科新创（厦门）科技有限公司HBsAg诊断试剂盒。以卫生部临检中心供应的2IU/ml HBsAg临界值血清作为参考品。

1.3.2  灭活效果实验：

        灭活后每份血清取2份用英科新创（厦门）科技有限公司HBsAg诊断试剂盒进行ELISA法作平行检测，检测过程严格按照说明书进行操作。

1.3.3  定值：

        将灭活后阳性血清全部混合，以卫生部临检中心供应的2IU/mlHBsAg临界值血清及罗氏公司提供的HBsAg异常质控血清作为参考品，进行ELISA法检测，六点非线性拟合做出标准曲线，依照待测物的吸光度（OD）值计算出相应待测物含量，应用稀释法调整浓度为2IU/ml 和10 IU/ml，分装量为每支0.2 ml，置2~8℃及-20℃冰箱保存。

1.3.4  稳定性实验：

        在不同时间抽取置2~8℃及-20℃条件保存下血清样本各三支，每份用ELISA法试剂盒检测，以卫生部临检中心供应的2IU/ml HBsAg临界值血清作为参考品，检测其含量的变化。

2  结  果

2.1  制备物靶值的确定：

        用生理盐水将制备物浓度进行对倍，4倍，8倍，16倍，32倍进行稀释，用ELISA法检测，先假定制备物浓度，并以试剂盒阴性对照作为0点，用美国StatFax-2100酶标仪进行六点非线性拟合定标，自动拟合标准曲线，检测卫生部临检中心提供的2IU/ml HBsAg临界值血清的测定值，根据测定值误差修正待测物假定值，再进行定标，直到卫生部临检中心提供的2IU/mlHBsAg临界值血清的测定值为2IU/ml为止（一般不超过三次），这时的假定值就是制备物的浓度，然后按照稀释法则把制备物稀释成浓度为2IU/ml和10IU/ml两种浓度的室内质控品，分装成200ul/瓶保存。

2.2  稳定性实验结果：

        不同条件下放置制备物的的稳定性进行长期监测，其结果见表1。

 2.3  制备物的均匀性检测：

        表1 不同温度下稳定性试验结果（单位：IU/ml）2007年10月至2008年10月间2IU/ml和10IU/ml样本含量监测数据9次的数据进行统计，计算其均值、标准差和瓶间变异（表2），该样本的瓶间差异为7.15%和8.97%。符合均匀性要求（国家一级标准物质对均匀性的要求取决于使用要求），其结果如下。

3  讨  论

        乙肝病毒表面抗原是诊断乙型肝炎的主要手段，目前，国内普遍使用ELISA定性法进行检测，ELISA定性法受反应温度、反应时间，交叉污染等多种因素影响，特别是对于低值弱阳性的判断缺乏统一标准，使得低值弱阳性结果不同实验室之间结果很难进行比较。为了解决这个问题，卫生部临检中心已经研制了用于进行HBsAg ELISA法检测国内标准品，单位为国际单位IU/ml。该标准物质已在许多三级医院得到广泛的应用，但价格偏贵，在许多中小医院仍没得到广泛的推广。室内质控的目的是使实验室测定结果趋于稳定。它应贯穿于分析前、中、后全过程，通过室内质控，详细掌握各阶段的变异，才能不断提高检验质量。因此推广使用室内质控极为重要。

        本研究参照卫生部临检中心的制备方法，含量的确定针对低值弱阳性判断的2IU/ml和高浓度10IU/ml。因为ELISA法检测HBsAg浓度与吸光度之间呈“S”型曲线分布特征^［6］，而2IU/ml是临床诊断的界限值，是室内质控精密度观察最敏感的窗口。同时，它还可以直接显示该试剂盒灵敏度是否达到2IU/ml、以防漏检，是提示试验成功与否的最重要标志。因此，我认为质控物{zh0}选用2IU/ml。另外，为防止HOOK现象、{zh0}同时进行高值质控10IU/ml。定值的准确性方面得到充分肯定。

         所制备的质控标准物质，在稳定性方面进行长期监测（表1），分别做了2IU/ml 2~8℃和10IU/ml 2~8℃三个月、2IU/ml-20℃和10IU/ml-20℃6个月的含量变化监测，其结果与制备当天无明显差异，表明达到国际标准要求（Quality of biotechnolocal products：Stability testing of biotechnological/biological products；Quality.Guideline-Active Substance Guideline 3AB5a．1995）。均一性检测结果：瓶间不精密度为7.15%和8.87% ，且批内精密度和总精密度差异无统计学意义，达到了国家一级标准物质的要求（一级标准物质技术规范，JJG1006．1994）。

        本文用60℃加热1h灭活法制备血清，自制简便易操作、经济、重复性、稳定性好，用于室内质控有很好的实用性，特别是中小医院更为合适。由于该定值制备物基质为普通急冻血清，在保存期限上较短，如果采用冻干血清，保存期限可延长。

【参考文献】
［1］ 方裕森，翁雪芬，叶靖，等. 室内质控血清的研制[J]. 实用医技杂志,2008,15(7):819-820.

［2］ 范秀芹，林凌云，岳志蹦，等. ELISA测定HBsAg室内质控问题的探讨[J]. 中国煤炭工业医学杂志，2002,1:89-92.

［3］ 李金明,王露楠,徐锡霞,等. 室内质量控制对乙型肝炎表面抗原测定准确度的影响[J]. 中华检验医学杂志,2001,24:255.

［4］ 袁龙生,陈永健. 乙肝表面抗原定量检测的室内质控建立[J]. 浙江临床医学,2003,12:893-894.

［5］ 王露楠,吴健民,李金明,等. 丙型肝炎病毒核酸检测的国家标准物质的研制[J]. 中华检验医学杂志,2006,4:354-355.

［6］ 孙关忠.美国Abbott Axsym免疫分析仪性能初步评价[J]. 21世纪论坛一浙江省检验医学学科发展和管理学术会议,2001,189-192.