血液样品进色谱柱前去蛋白处理

血液样品进色谱柱前去蛋白处理

2010-05-25 09:54:27 阅读25 评论0 字号:


血液样品进色谱柱前去蛋白处理

在做xx生物等效性实验,想知道血液样品进色谱柱前去蛋白处理的方法有那些,他们之间的优缺点,对xx是否有影响,请那位前辈高手指点一哈的 不是高手,说说我们试验的处理:
去蛋白处理目的:使结合的xx释放出来;避免提取时带入杂质和发生乳化;避免使色谱柱测试条件改变,如堵塞柱子等;
去蛋白方法:一是使用蛋白沉淀剂三氯醋酸,高氯酸等,一是用有机溶剂如甲醇,乙腈,乙酸乙酯等,加入2-4倍体积。
我们一般在样品中加甲醇(4倍体积),离心,取上清,加乙酸乙酯,蜗旋混匀,分层,取上清,再提一次,合并,氮气挥干。 可以看看这个具体的处理规范,应该会有收获
血液样品预处理的标准操作

规范高效液相色谱分析中血液样品预处理的操作。

1. 实验仪器与设备的预备
1.1 试管 一般采用有盖子和刻度的尖底试管,要求密封性好,编号清楚准确,并摆放整洁。
1.2 EP管 一般采用的规格有1ml、1.5ml、2 ml。要求密封性好,编号清楚准确,并摆放整洁。
1.3 移液器 要求定量准确,重复性好。
1.4 其它 涡流混合器、离心机、真空泵、烧杯、量筒、记号笔、试管架、标签纸等。
2. 样品的均匀化
2.1 将装有血浆(血清)样品的EP管放置在冰箱冷藏室内,缓慢解冻为血浆(血清)溶液。
2.2 然后取出放置至室温,置涡流混合器上混匀或往复振摇亦可到达均匀的目的。
3. 液-液提取
3.1 提取溶剂的预备
3.1.1 常用的溶剂有氯仿,二氯甲烷,乙酸乙酯,乙醚等。
3.1.2 提取溶剂可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液,目的是调整提取溶液的极性,既保证待测样品被充分萃取进入提取溶剂,同时又有很好的选择性。(具体选择要根据xx性质而变化)
3.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆(血清)至试管中,盖好试管塞。
3.3 必要时调整血浆(血清)溶液的pH值,根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。
3.4 用移液器定量吸取提取溶液至装有血浆(血清)的试管中,盖好试管塞。
3.5 溶液的混匀
3.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡,并保证样品溶液旋涡充分混匀,旋涡时间一般为2-3分钟。
3.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇,振摇时间一般为5-10分钟。
3.6 样品的离心 将试管置于离心机中,分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注重要平衡,加速时应注重缓慢逐步加速,以防加速过快试管炸裂,离心时间一般为15-20分钟。
3.7 离心分离后试管中样品分为上下两层,用移液器吸取上层有机相,转移至另一试管中。
3.8 溶剂的挥发 经过以上处理后得到的样品溶液,假如待测物的浓度在定量限以上,而且溶剂对HPLC系统没有干扰,就可以直接进样分析。但是在很多情况下需要除去溶剂,即浓缩甚至干燥样品。除溶剂时最重要的是不丢失或破坏待分析物质,同时还要考虑安全性和经济等。
3.8.1 自然挥发 将样品溶液放置在室温下挥发,有时还可适当加热,加速溶液挥发。
3.8.2 氮气吹干 氮气流能防止发生氧化,为了加快挥散速度,将样品溶液置于氮气流下吹干。
3.8.3 减压蒸发 在密闭容器内,通过抽真空以降低液体表面的压力,使其沸点降低,样品溶液很快挥发,减少了蒸发过程中样品与空气的接触,避免由此引起的分解等副反应,适于热不稳定的样品。
3.9 样品的复溶 用于样品溶液残渣复溶的溶液通常采用流动相或其它有机溶剂。用移液器准确定量吸取,并且复溶样品应充分混合均匀。
3.10 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室,样品应竖直放置、排列整洁、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出,以保证样品的稳定。
3.11 乳化现象
3.11.1防止乳化 可增加有机溶剂的体积,避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力等方法防止乳化。
3.11.2 破乳 若已发生严重的乳化现象,应采取适当的方法xx乳化。
3.11.2.1 离心 可将试管置于离心机中离心xx乳化。
3.11.2.2 冷冻 可将试管置于冰箱中冷冻xx乳化。
3.11.2.3 加入电解质。
3.11.2.4 加入适当的稀释液稀释。
4. 去蛋白处理
4.1 有机溶剂的预备 甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂,因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清亮,沉淀为絮状易于分离;乙腈与之相反,产生细的蛋白沉淀,但沉淀效率较甲醇高。
4.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆(血清)至试管中,盖好试管塞。text

4.3 必要时调整血浆(血清)溶液的pH值,根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。
4.4 用移液器定量吸取有机溶液至装有血浆(血清)的试管中,盖好试管塞。
4.5 溶液的混匀 有机溶剂使蛋白质变性而析出沉淀,从而把与蛋白质结合的xx解离出来。与此同时待测样品大部分被萃取进入有机溶剂。
4.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡,并保证样品溶液旋涡充分混匀,旋涡时间一般为2-3分钟。
4.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇,振摇时间一般为5-10分钟。
4.6 离心去除蛋白 将试管置于离心机中,分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注重要平衡,加速时应注重缓慢逐步加速,以防加速过快试管炸裂,离心时间一般为15-20分钟。
4.7 离心分离后变性蛋白质沉淀于试管底部,用移液器吸取上层有机溶液,转移至另一试管中。
4.8 过滤 经过去蛋白处理后的样品溶液用0.45μm的滤膜过滤。
4.9 高速离心 将过滤后的样品溶液转移至EP管中,采用25000-30000 r/min。离心之前注重要平衡,加速时应注重缓慢逐步加速,以防加速过快试管炸裂,离心时间一般为5-10分钟。
4.10经过以上处理后得到的样品溶液,假如待测物的浓度在定量限以上,而且溶剂对HPLC系统没有干扰,就可以直接进样分析。假如需要除去溶剂,即浓缩甚至干燥样品,方法同3.8-3.9。
4.11 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室,样品应竖直放置、排列整洁、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出,以保证样品的稳定。
5. 固相萃取
5.1 固相萃取柱的预备
5.1.1 柱管 由血清级的聚丙烯制成(也有由玻璃制成的),一般为注射器性状。柱管下断有一突出的头,尺寸已标准化。
5.1.2 烧结垫 聚乙烯是常见的烧结垫材料,对于非凡要求也可采用特氟隆或不锈钢片。

 

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4倍甲醇沉淀蛋白


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