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血液样品进色谱柱前去蛋白处理

在做xx生物等效性实验,想知道血液样品进色谱柱前去蛋白处理的方法有那些,他们之间的优缺点,对xx是否有影响,请那位前辈高手指点一哈的 不是高手，说说我们试验的处理：
去蛋白处理目的：使结合的xx释放出来；避免提取时带入杂质和发生乳化；避免使色谱柱测试条件改变，如堵塞柱子等；
去蛋白方法：一是使用蛋白沉淀剂三氯醋酸，高氯酸等，一是用有机溶剂如甲醇，乙腈，乙酸乙酯等，加入2-4倍体积。
我们一般在样品中加甲醇（4倍体积），离心，取上清，加乙酸乙酯，蜗旋混匀，分层，取上清，再提一次，合并，氮气挥干。 可以看看这个具体的处理规范，应该会有收获
血液样品预处理的标准操作

规范高效液相色谱分析中血液样品预处理的操作。

1. 实验仪器与设备的预备
1.1 试管 一般采用有盖子和刻度的尖底试管，要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整洁。
1.2 EP管 一般采用的规格有1ml、1.5ml、2 ml。要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整洁。
1.3 移液器 要求定量准确，重复性好。
1.4 其它 涡流混合器、离心机、真空泵、烧杯、量筒、记号笔、试管架、标签纸等。
2. 样品的均匀化
2.1 将装有血浆（血清）样品的EP管放置在冰箱冷藏室内，缓慢解冻为血浆（血清）溶液。
2.2 然后取出放置至室温，置涡流混合器上混匀或往复振摇亦可到达均匀的目的。
3. 液－液提取
3.1 提取溶剂的预备
3.1.1 常用的溶剂有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醚等。
3.1.2 提取溶剂可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液，目的是调整提取溶液的极性，既保证待测样品被充分萃取进入提取溶剂，同时又有很好的选择性。（具体选择要根据xx性质而变化）
3.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆（血清）至试管中，盖好试管塞。
3.3 必要时调整血浆（血清）溶液的pH值，根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。
3.4 用移液器定量吸取提取溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。
3.5 溶液的混匀
3.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡，并保证样品溶液旋涡充分混匀，旋涡时间一般为2-3分钟。
3.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇，振摇时间一般为5-10分钟。
3.6 样品的离心 将试管置于离心机中，分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注重要平衡，加速时应注重缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为15-20分钟。
3.7 离心分离后试管中样品分为上下两层，用移液器吸取上层有机相，转移至另一试管中。
3.8 溶剂的挥发 经过以上处理后得到的样品溶液，假如待测物的浓度在定量限以上，而且溶剂对HPLC系统没有干扰，就可以直接进样分析。但是在很多情况下需要除去溶剂，即浓缩甚至干燥样品。除溶剂时最重要的是不丢失或破坏待分析物质，同时还要考虑安全性和经济等。
3.8.1 自然挥发 将样品溶液放置在室温下挥发，有时还可适当加热，加速溶液挥发。
3.8.2 氮气吹干 氮气流能防止发生氧化，为了加快挥散速度，将样品溶液置于氮气流下吹干。
3.8.3 减压蒸发 在密闭容器内，通过抽真空以降低液体表面的压力，使其沸点降低，样品溶液很快挥发，减少了蒸发过程中样品与空气的接触，避免由此引起的分解等副反应，适于热不稳定的样品。
3.9 样品的复溶 用于样品溶液残渣复溶的溶液通常采用流动相或其它有机溶剂。用移液器准确定量吸取，并且复溶样品应充分混合均匀。
3.10 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整洁、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。
3.11 乳化现象
3.11.1防止乳化 可增加有机溶剂的体积，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力等方法防止乳化。
3.11.2 破乳 若已发生严重的乳化现象，应采取适当的方法xx乳化。
3.11.2.1 离心 可将试管置于离心机中离心xx乳化。
3.11.2.2 冷冻 可将试管置于冰箱中冷冻xx乳化。
3.11.2.3 加入电解质。
3.11.2.4 加入适当的稀释液稀释。
4. 去蛋白处理
4.1 有机溶剂的预备 甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂，因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清亮，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀，但沉淀效率较甲醇高。
4.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆（血清）至试管中，盖好试管塞。text

4.3 必要时调整血浆（血清）溶液的pH值，根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。
4.4 用移液器定量吸取有机溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。
4.5 溶液的混匀 有机溶剂使蛋白质变性而析出沉淀，从而把与蛋白质结合的xx解离出来。与此同时待测样品大部分被萃取进入有机溶剂。
4.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡，并保证样品溶液旋涡充分混匀，旋涡时间一般为2-3分钟。
4.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇，振摇时间一般为5-10分钟。
4.6 离心去除蛋白 将试管置于离心机中，分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注重要平衡，加速时应注重缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为15-20分钟。
4.7 离心分离后变性蛋白质沉淀于试管底部，用移液器吸取上层有机溶液，转移至另一试管中。
4.8 过滤 经过去蛋白处理后的样品溶液用0.45μm的滤膜过滤。
4.9 高速离心 将过滤后的样品溶液转移至EP管中，采用25000-30000 r/min。离心之前注重要平衡，加速时应注重缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为5-10分钟。
4.10经过以上处理后得到的样品溶液，假如待测物的浓度在定量限以上，而且溶剂对HPLC系统没有干扰，就可以直接进样分析。假如需要除去溶剂，即浓缩甚至干燥样品，方法同3.8-3.9。
4.11 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整洁、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。
5. 固相萃取
5.1 固相萃取柱的预备
5.1.1 柱管 由血清级的聚丙烯制成（也有由玻璃制成的），一般为注射器性状。柱管下断有一突出的头，尺寸已标准化。
5.1.2 烧结垫 聚乙烯是常见的烧结垫材料，对于非凡要求也可采用特氟隆或不锈钢片。

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4倍甲醇沉淀蛋白

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