付海英fuhaiying612@yahoo.com.cn
实验流程
1W
1.双向免疫扩散试验③ 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) ④
OVA (1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔内注射500 μl
OVA+CFA加强免疫小鼠500 μl ①
摘眼球取血无菌取脾和胸腺②
分离血清②
2W
取脾和胸腺②
淋巴细胞转化试验②
生理盐水(500 μl )免疫小鼠腹腔内注射
生理盐水加强免疫小鼠500 μl ①
2W
After 1W
对照组
实验组
抗体效价
增殖功能
实验内容
小鼠摘眼球取血、分离血清淋巴细胞转化试验
教学要求
掌握小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作
淋巴细胞转化试验(Lymphocyte transformation test)
原理检测方法操作步骤应用
实验分组及材料
器材酒精棉球若干无菌纱布块 1块/组无菌平皿1块/组无菌吸头(大、中、小)4盒/room无菌96孔培养板1块/组可调微量加样器4套/room细胞计数板1套/组显微镜1台/组EP管若干眼科剪、小镊子4套/room细胞培养箱(37℃ 5%CO2)
酶标仪离心机2个/room超净台2个/room动物及试剂小鼠 2只/组(NS,OVA)培养液(IMDM) 无FCS 100ml/room培养液(IMDM)20%FCS 30ml/roomConA(2.5,5,10μg/ml) 各1.5ml/tube 白细胞计数液(2%冰醋酸)2瓶/roomMTT(5mg/ml) 1.5ml/room二甲亚砜(DMSO) 5ml/组
分组: 每组四人,两人一只小鼠,其中一人胸腺,一人脾脏
免疫血清分离过程
摘眼球取血
RT for 2hrs
Rotation3000rpm for 20min
Transfer serum to a new EP
Double diffusion
Store at 4℃
ELISA
1.5ml EP
实验步骤
单细胞悬液的制备:小鼠脱臼处死,用酒精棉球擦拭皮毛xx.于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2),分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内.将3-4层纱布覆盖到组织上,用直头镊子固定组织,用弯头镊子轻压组织,将其捣碎.然后用1000μl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出,放入1.5ml EP管中.细胞计数:取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20μl,加到盛有980μl计数液的EP管中,在显微镜下计数,计数方法见后.调细胞浓度至1*107/ml,所需量为1.5ml,设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式:?/ml*A=1.5*1*107NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀,否则细胞长时间沉淀使细胞数不准.
细胞计数板
查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的细胞数:Y=X/4每个大方格的体积为V=1mm*1mm*0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度(/ml)=Y *104*稀释倍数(50)
4
细胞培养:按图所示加板.将板做好标记,在倒置显微镜下观察细胞,然后放于37℃ 5%C02培养箱中,培养48小时.MTT掺入:(隔{yt} 下午2:00)在终止培养前2小时,在显微镜下观察细胞转化情况.每孔内加入MTT(5mg/ml) 10μl,加完后轻轻搕板,使MTT和细胞混匀.在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时,然后离心2000rpm,5min,轻轻弃去上清,(注意不要将孔底部的颗粒物弃出).加入100μl 二甲亚砜(DMSO),将颗粒溶解. (隔{yt} 下午4:00)结果测定:结果测量:用酶标仪测定光密度值:A570nm(用空白孔调零),记录结果.结果判定: SI(刺激指数)=Con A刺激孔 A值/对照孔A值
预习内容
单克隆抗体的制备(理论P70,实验P106)双向免疫扩散(理论P241,实验P116)
八个人一块培养板,两人加脾,两人加胸腺每孔加入100 μl调好的细胞悬液1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液, 100 μl 4-6孔加入2.5 μg/ml的Con A,100 μl 7-9孔加入5 μg/ml的Con A, 100 μl 10-12孔加入10 μg/ml的Con A, 100 μl NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制
thymus Cell+ ConA 10μg/ml
thymus cell+ConA 5μg/ml
thymus cell+ ConA 2.5μg/ml
thymus cell+10% IMDM
D
thymus Cell+ ConA 10μg/ml
thymus cell+ConA 5μg/ml
thymus cell+ ConA 2.5μg/ml
thymus cell+10% IMDM
C
spleen Cell+ ConA 10μg/ml
spleen cell+ConA 5μg/ml
spleen cell+ ConA 2.5μg/ml
spleen cell+10% IMDM
B
spleen Cell+ ConA 10μg/ml
spleen cell+ConA 5μg/ml
spleen cell+ ConA 2.5μg/ml
spleen cell+10% IMDM
A
10-12
7-9
4-6
1-3
N.S.
OVA
N.S.
OVA
加样方法
返回
八个人一块培养板,两人加脾,两人加胸腺每孔加入100 μl调好的细胞悬液1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液, 100 μl 4-6孔加入2.5 μg/ml的Con A, 100 μl 7-9孔加入5 μg/ml的Con A, 100 μl 10-12孔加入10 μg/ml的Con A, 100 μl
thymus Cell+ ConA 10μg/ml
thymus cell+ConA 5μg/ml
thymus cell+ ConA 2.5μg/ml
thymus cell+10% IMDM
D
thymus Cell+ ConA 10μg/ml
thymus cell+ConA 5μg/ml
thymus cell+ ConA 2.5μg/ml
thymus cell+10% IMDM
C
spleen Cell+ ConA 10μg/ml
spleen cell+ConA 5μg/ml
spleen cell+ ConA 2.5μg/ml
spleen cell+10% IMDM
B
spleen Cell+ ConA 10μg/ml
spleen cell+ConA 5μg/ml
spleen cell+ ConA 2.5μg/ml
spleen cell+10% IMDM
A
10-12
7-9
4-6
1-3
N.S.
OVA
N.S.
OVA
加样方法