作者：郭志强 徐丹 万谦宏 陈磊*    作者单位：天津大学xx科学与技术学院，天津 300072

【摘要】  　　二氢麦角碱的4种组分具有不同的药效特性，需适当的分析方法对其在不同剂型药品中的含量进行分析。传统液相色谱方法使用强碱性流动相，严重腐蚀硅胶基质色谱填料，影响色谱柱寿命。合成了极性嵌入反相固定相——C18酰胺固定相，并在中性流动相条件下分离4种组分。考察了流动相组成和pH对二氢麦角碱在C18酰胺固定相上保留行为的影响。在150 mm×4.6 mm I.D.的C18酰胺色谱柱上，流动相为乙腈20 mmol/L Na2HPO4(30∶70，Ｖ/Ｖ，pH 7.0)的条件下实现了４种组分的基线分离。与传统方法相比，极性嵌入反相固定相可以有效的改善碱性化合物的分离特性和大幅度地延长色谱柱的使用寿命。

【关键词】  二氢麦角碱 生物碱 C18酰胺 极性嵌入色谱固定相

　　1  引言
   
　　二氢麦角碱是由等量的二氢麦角可宁、二氢麦角汀和α，β二氢麦角隐亭甲磺酸盐4种成分组成的混合物（图1），能直接作用于中枢多巴胺和5羟色胺受体，改善神经传递，缓解血管痉孪，临床上用于xx与老年化有关的精神退化症[1]。由于4种组分具有不同的药效特性[2，３]，需要建立不同剂型药品中各成分含量的测定方法[４]。α，β二氢麦角隐亭异构体极性强弱差别很小，在反相硅胶基质填料适用的流动相pH范围(2.0～8.0)内，分离效果差。Hartmann等[５]采用强碱性流动相的反相液相色谱法实现了４种组分的基线分离。可是，强碱性流动相对硅胶基质填料有腐蚀作用，严重缩短色谱柱的使用寿命。
     
　　图1  4种二氢麦角碱的结构（略）

　　Fig.1  Structures of four components of dihydroergotoxine alkaloids

　　极性嵌入反相色谱固定相是近年来发展起来的一类新型色谱固定相[8]，通过在传统烷基固定相长链根部嵌入酰胺、氨基甲酸酯等极性基团而获得，对具有复杂结构的碱性化合物表现出不同于传统反相色谱的分离性能[７～9]。采用本研究合成的C18酰胺固定相，对二氢麦角碱4种组分进行色谱分离，考察了流动相组成和pH对色谱保留行为的影响。在中性pH条件下，二氢麦角碱4种组分获得了基线分离。

　　2.1  试剂和材料
   
　　γ氨丙基三乙氧基硅烷（湖北应城化工新材料有限公司）；硬脂酸、二氯亚砜、甲苯、三乙胺、醋酸钠和Ｎa2HPO4均为分析纯(天津市江天化工技术有限公司);乙腈和甲醇为色谱纯(天津市康科德科技有限公司);二氢麦角碱甲磺酸(天津市汉康医药生物技术有限公司)。球形硅胶基质(BaseLine Sil，粒径5 μm，比表面积300 m2/g，孔径1000 nm，天津市倍思乐色谱技术开发中心)。

　　2.2  C18酰胺固定相的制备
   
　　参考文献[1０]报道的方法制备固定相。在三口瓶中依次加入23.8 g硬脂酸和30.6 mL二氯亚砜，回流7 h，旋蒸，得到十八酰氯。取15.0 mL γ氨丙基三乙氧基硅烷，加入25.0 mL上述制得的十八酰氯，得深红色液体为十八烷基酰胺丙基三乙氧基硅烷。取15.0 g干燥球形硅胶置于三口瓶中，依次加入100.0 mL甲苯，1.0 mL三乙胺和8.0 mL十八烷基酰胺丙基三乙氧基硅烷，通入氮气，搅拌，110 ℃回流8 h，冷却，依次用甲苯、甲醇、丙酮洗涤，60 ℃真空干燥。于700 ℃煅烧，测得C18酰胺固定相失重率为9.8%，由此估算其碳载量为7.2%。采用高压匀浆法填装C18酰胺色谱柱。

　　2.3  色谱评价
   
　　液相色谱系统由Thermal Separation Products (TSP) P4000四元输液泵、在线脱气机、UV1000可变波长紫外检测器（San Jose, CA, USA）、Rheodyne 7725i进样阀（Cotati, CA, USA）和N2000色谱工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）组成。实验在室温下操作，每次样品注射量为5 μＬ，UV 280 nm 检测。

　　2.4  毛细管电泳仪及方法
   
　　TH2000毛细管电泳仪（保定市高新区天惠分离科学研究所）；TJ2000色谱数据工作站（北京创新通恒科技有限公司），工作波长280 nm，石英毛细管（88 cm×75 μm I.D.，河北省邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司）。毛细管使用前依次用0.1 mol/L NaOH、超纯水和运行缓冲液各冲洗10 min。两次运行之间用超纯水和缓冲液各冲洗3 min。采用10 kV×15 s电迁移进样，室温，运行电压15 kV，UV 280 nm检测。   

　　3.1  流动相pH对二氢麦角碱保留行为的影响
   
　　二氢麦角碱分子中均含有胺基和羟基，在一定pH值下发生解离，而导致保留行为的改变。采用毛细管区带电泳测定二氢麦角碱的等电点。 
　　图2  二氢麦角碱(a)和丙酮(b)在不同pH缓冲液中的迁移时间（略）

　　Fig.2  Migration time of dihydroergotoxine(a) and acetone(b) in different pH running buffer

　　固定磷酸盐缓冲液浓度为25.0 mmol/L，用三乙胺调节pH分别为9.0、10.0、11.0和11.5，通过测定二氢麦角碱和丙酮的相对迁移时间，研究pH对4种组分解离的影响，结果如图2所示。由图2可以看出，pH低于10.0时，二氢麦角碱的迁移时间早于丙酮，表明此条件下4种组分均带正电荷；而pH高于11.0时，二氢麦角碱的迁移时间滞后于丙酮，均带负电荷。由此可以推断4种组分的等电点（pI）在10.0～10.5范围内。当pH低于pI时，4种组分均带正电荷；随着pH的增高，正电荷逐渐减少；pH高于pI时，由于12′羟基的解离而带负电荷。
   
　　采用乙腈20 mmol/L Na2HPO4 (30∶70，Ｖ/Ｖ)作流动相，用H3PO4调节pH在3.0～8.0范围内，考察pH对保留行为的影响，结果如图3所示。当pH从3.0提高到4.0时，4种组分均保留较弱且变化较小，对α，β异构体没有任何分离选择性；继续提高pH，保留迅速增强。当pH达到5.0时，异构体开始有一定的分离，随着pH的增高，异构体的相对保留产生了较大的差别，在pH 7.0时，获得了{zd0}程度的分离。

　　图3  pH对二氢麦角可宁(１)，α二氢麦角隐亭(２)，β二氢麦角隐亭(３)和二氢麦角汀(４)保留行为和分离选择性（α）的影响（略）

　　Fig.3  Effect of pH on retention factor (k) of dihydroergocornine(１)， dihydroαergocryptine(２)，dihydroβergocryptine(３) and dihydroergocristine(４) and the relative retention(α)(５) of dihydroαergocryptine and dihydroβergocryptine

　　色谱柱(column)：C18酰胺(C18 amide) 150 mm×4.6 mm I.D.；流动相(mobile phase)：乙腈(acetonitrile, ACN)20 mmol/L Na2HPO4 (30∶70，Ｖ/Ｖ)；流速(flow rate)：1.0 mL/min。

　　3.2  缓冲盐类型和浓度对二氢麦角碱保留行为的影响
   
　　以合成的C18酰胺固定相装填色谱柱，分别选择Na2HPO4和CH3COONa作为缓冲盐，考察二氢麦角碱组分的保留因子（k）的差别，结果如表1所示。由表1可以看出，当采用醋酸钠作为缓冲盐时，4种组分的保留均稍弱于Na2HPO4，但后者分离选择性更高。后续实验中的缓冲盐均选用磷酸盐。

　　表1  缓冲盐种类对二氢麦角碱保留因子(k)的影响（略）

　　Table 1  Effect of different buffer salts on the retention factor(k) of dihydroergotoxine

　　为了进一步考察缓冲盐浓度对保留行为的影响，将流动相中的缓冲盐浓度从5 mmol/L提高到50 mmol/L，其对保留因子（k）的影响如图4所示。在pH 4.0条件下，缓冲盐浓度从5 mmol/L增加到20 mmol/L时，保留显著增强，继续增加缓冲盐浓度到50 mmol/L则保留因子变化不再明显；而在pH 7.0条件下，缓冲盐浓度从5 mmol/L提高到10 mmol/L时，保留显著增强，继续增加缓冲盐的浓度至50 mmol/L则逐渐减弱。隐亭异构体的分离选择性基本不受缓冲盐浓度的影响。
 
　　图4  pH 4.0和pH 7.0条件下，磷酸盐缓冲液浓度对二氢麦角可宁(１)、α二氢麦角隐亭(２)、β二氢麦角隐亭(３)和二氢麦角汀(４)的保留行为的影响（略）

　　Fig.4  Effect of concentration of phosphate buffer on the retention factor (k) of dihydroergocornine (１)，dihydroαergocryptine(２)，dihydroβergocryptine (３), dihydroergocristine(４) of dihydroαergocryptine and dihydroβergocryptine at pH 4.0 and pH 7.0

　　流动相(mobile phase)：乙腈(ACN)Na2HPO4 pH 4.0 和7.0 (30∶70，Ｖ/Ｖ)。其它色谱条件同图3(other conditions are the same as in Fig.3)。

　　3.3  有机相种类及含量对二氢麦角碱保留行为的影响
   
　　固定缓冲液浓度为20 mmol/L Na2HPO4，pH 7.0，分别采用甲醇和乙腈作为有机相，调整其在流动相中的比例以保证溶剂强度一致，考察二氢麦角碱组分的保留行为，如表2所示。由表2可见，4种组分在乙腈流动相中保留较弱同时分离选择性较高；但在40%甲醇流动相中3 h内仍未见样品的洗脱峰。进一步改变流动相中乙腈的含量，结果如图5所示。随着乙腈含量的减少，4种组分的保留逐渐增强，隐亭异构体的相对保留因子(α)逐渐增大，在乙腈比例为30%时对两异构体的分离选择性{zh0}。

　　3.4  二氢麦角碱在C18酰胺固定相上的保留机理
   
　　C18酰胺固定相表面存在残存硅羟基和氨基，酰胺基团和嵌有极性基团的疏水长链烷基等多个作用位点[６,1１～1４]，使得二氢麦角碱在其上的保留机理比普通C18固定相更加复杂。
   
　　由图3可以看出，pH由3.0增大到5.0，二氢麦角碱在固定相上的保留逐渐增强;而pH由5.0增大到8.0，保留迅速增强。这是由于在低pH条件下，二氢麦角碱组分充分质子化，与固定相间存在较强的静电排斥作用，因此保留较弱且分离选择性也较差。随着pH升高，溶质与固定相表面残存氨基质子化程度均逐渐降低，静电排斥作用影响逐渐减小，而疏水相互作用增强，硅羟基离子化程度逐渐提高，静电吸引力变化不确定，这3种作用力随着流动相pH的提高变化的程度不同，导致4种组分间相对保留因子(α)逐渐提高。由图4可以看出，在缓冲盐低浓度（5～20 mmol/L）范围内，其浓度变化对二氢麦角碱在C18酰胺固定相上的保留行为影响比较显著。由以上实验测得二氢麦角碱的等电点在10.0～10.5之间，在pH 3.0～8.0范围内，二氢麦角碱与固定相表面氨基质子化，存在静电排斥作用，同时由于硅羟基的解离，与二氢麦角碱之间也有静电吸引作用，而显然静电排斥强于静电吸引作用，这可能是C18酰胺固定相能分离一些在传统反相固定相上不能或难以分离的化合物的主要原因。缓冲盐浓度的增加削弱了溶质和固定相间的静电相互作用[1５]。而随着盐浓度增加，静电作用被xx抑制后，保留值变化趋于平稳。这时固定缓冲盐浓度和pH值大小不变，降低流动相中乙腈含量，溶质与流动相间的作用降低，4种组分保留增强而且程度不同，相对保留因子逐渐提高，表明在此条件下疏水相互作用影响强于静电相互作用（图5所示）。

　　表2  有机溶剂对二氢麦角碱保留因子(k)的影响（略）

　　Table 2  Effect of different organic phases on the retention factor (k) of dihydroergotoxine4

　　ND：在3 h内未检测到洗脱信号 (not detected in 3 h)。 

　　图5  乙腈含量对二氢麦角可宁(１)、α二氢麦角隐亭(２)、β二氢麦角隐亭(３)和二氢麦角汀(4)的保留行为和分离选择性（5）的影响（略）

　　Fig.5  Effect of acetonitrile content on the retention factor(k) of dihydroergocornine(１)， dihydroαergocryptine(２)，dihydroβergocryptine(３) and dihydroergocristine(４) and the relative retention(α) (５) of dihydroαergocryptine and dihydroβergocryptine

　　缓冲盐溶液(concentration of buffer solutim)： 20 mmol/L Na2HPO4， pH 7.0。其它色谱条件同图3(other conditions are the same as in Fig.3)。
   
　　综上所述，由二氢麦角碱在C18酰胺固定相上的保留行为可以推论出，溶质在固定相上的保留过程除了传统C18固定相的疏水作用外，还存在静电吸引和排斥作用，是多种模式共同作用的结果。

　　3.5  C18酰胺固定相在优化的色谱条件下对二氢麦角碱的分离
   
　　图6为二氢麦角碱组分在150 mm×4.6 mm I.D.的C18酰胺色谱柱上，以乙腈20 mmol/L Na2HPO4(30∶70，Ｖ/Ｖ)，pH 7.0为流动相的分离色谱图。在中性pH条件下对4种组分实现了基线分离。

　　图6  二氢麦角碱在C18酰胺固定相上的分离色谱图（略）

　　Fig.6  HPLC chromatogram separation of dihydroergotoxine on the C18 amide phase

　　流动相(mobile phase)： 乙腈(ACN)20 mmol/L Na2HPO4(30∶70, Ｖ/Ｖ)，pH 7.0。 其它色谱条件同图3(other conditions are the same as in Fig.3)。1. 二氢麦角可宁(dihydroergocornine)； 2. α二氢麦角隐亭(dihydroαergocryptine)； 3. β二氢麦角隐亭(dihydroβergocryptine)；4. 二氢麦角汀(dihydroergocristine)。   

　　研究结果表明，本方法与传统方法相比，可以大幅度延长色谱柱的使用寿命，实现了对二氢麦角碱甲磺酸不同剂型药品中4种组分的定量检测。鉴于二氢麦角碱在C18酰胺固定相上的良好峰形和分离选择性，预期此类固定相可以应用于结构复杂的生物碱类化合物的分离分析，在xx分析，xx产物鉴定等领域具有较大的应用潜力。

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