肾移植后抗HLA和MICA抗体对移植肾慢性排斥反应的影响

赵色玲，李留洋，郭颖，刘永光，钱俊，陈剑荣，李民，赵明

0　引　　言

　　肾移植后慢性排斥反应可引起移植肾功能的缓慢丧失。早期人们对T淋巴细胞介导的细胞性排斥反应进行了深入研究，目前临床应用的免疫抑制剂主要用于预防和xx细胞性排斥反应。但随着人们对移植排斥反应研究的不断深入和实验技术的日益进步，越来越多的研究表明，特异性抗体介导的体液性排斥反应对移植物损伤产生了十分重要的作用。抗供者特异性HLA抗体是引起超急性排斥反应的关键因素，并可造成急性排斥反应、慢性排斥反应和移植物功能延迟等。近年研究发现，抗MICA抗体介导的体液免疫反应亦与移植物的排斥和存活密切相关。实验通过监测肾移植受者移植前后的体液免疫状态，探讨抗HLA和MlCA抗体介导移植肾慢性排斥反应的发病机制及其对移植物长期存活的影响。

1　对象和方法

　　设计：动态分析，病例对照观察。

　　时间及地点：2001-01／2006-06南方医科大学附属珠江医院器官移植科。

　　对象：选择接受肾移后长期随访的患者60例，男32例，女28例，年龄25～73岁，平均(45.3±10.8)岁。初次肾移植54例，二次移植6例。术后采用环孢素(CsA)／普乐可复(FK506)+霉酚酸酯(MMF)+泼尼松三联免疫抑制剂方案维持xx；所有受者均进行规律的临床随访，定期复查血、尿常规、肾功能及血药浓度，并收集相关的资料，包括临床表现、实验室检查及移植肾穿刺病理检查等。本组移植肾慢性排斥反应受者34例，均经移植肾穿刺病理检查确诊。取对照组为同期手术至2007-01移植肾功能仍稳定的26例肾移植受者。所有患者在接受本实验相关检测及xx前均签署了知情同意书。

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　　方法：

　　慢性排斥反应诊断标准：

　　临床表现：血肌酐异常，升高＞133μmol／L(正常值44～133μmol／L)发生在肾移植术后＞6个月，给予甲泼尼龙冲击xx和调整免疫抑制剂等处理后肾功能无好转，移植肾功能呈进行性减退。

　　辅助检查：血肌酐异常，升高＞133μmol／L，通过移植肾彩超、CsA血药浓度检测等，初步排除CNIxx中毒、梗阻／返流、肾血管狭窄、感染等可导致肾功能慢性损害的原因。

　　移植肾穿刺与组织学检查：根据Banff 2003分类标准在组织学上移植肾没有急性排斥反应、急性CNI中毒、肾小球肾炎复发等特征性的病理改变，而是呈现以慢性移植肾肾小球病，非特异性的肾小管萎缩及间质纤维化，在肾血管方面表现为内膜明显的向心性纤维性增厚，平滑肌增生和反复单核细胞浸润等为特点的病理改变。

　　抗HLA抗体的监测：应用One Lambda混合抗原板(LATM)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测受者肾移植术前血清中的抗HLA抗体，于2007-08／07检测受者术后抗体情况，对阳性血清进一步用抗原板(LAT1240和LAT1HDS)检测抗体阳性率及其特异性，监测肾移植受者手术前后外周血中抗HLA抗体的水平及其特异性的动态变化。

　　抗MICA抗体的监测：采用免疫磁珠流式细胞仪液相芯片技术(Luminex flow cytometry)检测肾移植受者移植后外周血中抗MICA抗体情况。在Terasaki微孔板中分别加入5μL LABScreenO Mixed荧光微球和20μL受者血清或阴性对照血清，20～25℃下轻轻摇动避光孵育30min。孵育后，每孔加入150μL 1×洗液，覆盖密封膜(SSPSEA300)后震荡，1300×g离心5min，弃掉孔里的洗液，洗板3次。按1:100的比例稀释PE-羊抗人IgG结合物(LS-AB2)至1×抗体工作液，每孔中加入100μL 1×抗人IgG-PE震荡混匀，20-25℃下轻轻摇动避光孵育30min，洗涤同上。每孔加入80μL PBS，覆盖新的密封膜后震荡混匀，应用LABScan 100流式分析仪读取数据和分析结果。

　　HLA分型：HLA分型方法：参见文献。

　　供受者HLA配型：采用自主研究开发的器官移植供受者HLA快速配型软件，根据Ⅰ类HLA抗原交叉反应组配型标准和Ⅱ类抗原可接性错配原则进行供受者配型。

　　主要观察指标： ①肾移植患者手术前后抗HLA抗体滴度及特异性的动态变化。 ②受者术后抗MICA抗体合成情况。 ③移植肾功能。 ④移植受者及移植物的存活率。

　　设计、实施、评估者：实验设计为{dy}、二作者，实施、评估为全部作者，未采用盲法评估。

　　统计学分析：由{dy}作者采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理，计数资料间的比较采用χ²检验，计量资料以±表示，组间比较采用one-way ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　抗HLA和MICA抗体检测结果　在60例患者中抗体阳性者33例，阳性率为55％，其中抗HLA抗体阳性19例(抗HLA-Ⅰ类抗体阳性1例，抗HLA-Ⅱ类抗体阳性9例，抗HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗体均阳性9例)，抗MICA抗体阳性21例，其中抗HLA 抗体和抗MICA抗体均阳性7例。

2.2　慢性排斥组和肾功能稳定组受者抗体阳性率比较

　　肾移植后慢性排斥组抗体阳性率明显高于移植肾功能稳定组受者。47.1％的慢性排斥患者出现抗HLA抗体，而移植肾功能稳定组受者仅11.5％检测到抗HLA抗体，两者比较有显著性差异(P＜0.01)。两组间抗MICA抗体的比较也有相同的趋势，慢性排斥组的抗MICA抗体阳性率显著高于肾功能稳定组(47.1％与19.2％，P＜0.05)。慢性排斥组总抗体阳性率(抗HLA／MICA抗体)为73.5％，而移植肾功能稳定组受者仅30.8％出现抗体，两组差异更为明显(P＜0.01)，结果见表1。

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2.3　抗HLA和MICA抗体对移植肾功能的影响

　　根据术后抗HLA抗体和抗MICA抗体情况分为以下4组：

　　抗HLA抗体阴性，抗MICA抗体阴性，即anti-HLA-／anti-MICA-组。

　　抗HLA抗体阳性，抗MICA抗体阴性，即anti-HLA+／anti-MICA-组。

　　抗HLA抗体阴性，抗MICA抗体阳性，即anti-HLA-／anti-MICA+组。

　　抗HLA抗体阳性，抗MiCA抗体阳性，即anti-HLA+／anti-MICA+组。

　　经方差分析提示，anti-HLA+／anti-MICA+组在手术后1，2和3年时血肌酐水平高于其余3组(P＜0.05)。anti-HLA-／anti-MICA-组与anti-HLA-／anti-MICA+组比较，移植后1，2和3年时血肌酐水平的差异无显著性(P＞0.05)。移植6个月，1，2和3年时，抗体阳性组受者的血肌酐水平与抗体阴性组比较，明显升高，见表2。

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3　讨　　论

　　自从1960年Terasaki发明了补体依赖细胞毒试验用于检测循环中抗HLA抗体以来，人们对抗体介导体液性排斥反应进行了大量的实验和临床研究，取得了丰硕的成果。根据移植排斥体液免疫理论，抗体是引起同种移植排斥反应的重要原因，主要表现在： ①抗体引起肾移植的超急性排斥反应。 ②抗体导致与早期移植肾功能损害相关的C4d在肾小球和肾小管周围xxxx壁上的沉积。 ③抗体是早期预测移植肾急性排斥反应的良好指标。 ④发生肾移植排斥的患者中绝大多数存在抗体。 ⑤抗体不仅与肾移植，而且与心脏移植、肺移植和肝移植的慢性排斥反应密切相关。外周循环中的抗体常出现在移植肾排斥和细xxxx性闭塞之前。

　　肾移植受者在受到同种HLA抗原致敏后，外周血中容易产生抗HLA抗体，其中IgG型抗HLA抗体是引起超急性排斥反应的关键因素，并且与急性排斥反应、慢性排斥反应和移植物功能延迟等密切相关。Lee等的随访研究发现，发生移植肾慢性排斥反应的患者其体内新生抗HLA抗体阳性率显著高于移植肾功能稳定受者(48.3％和27％，P＜0.01)，提示抗移植物抗体介导的慢性损害是导致慢性排斥反应的重要原因。多中心合作研究发现，移植后抗HLA抗体阳性的受者移植肾失功率显著高于术后抗体阴性受者(6.6％和3.3％，P＜0.01)，而移植前抗体阴性，移植后产生新生抗体患者移植肾失功率高达8.6％，与无新生抗体受者的差异更为明显。这些研究提示术后新生抗HLA抗体与移植肾失功显著相关，移植后抗HLA抗体产生是移植物失功的一个很好的预测指标。实验结果显示，34例移植肾慢性排斥患者中有16例抗HLA抗体阳性(47.1％)，而26例移植肾功能稳定受者只有3例出现抗HLA抗体(19.2％)，两组比较有显著性差异(P＜0.05)。在移植后的随访中发现，抗HLA抗体阳性组受者血肌酐水平明显高于抗体阴性组。在影响移植肾长期存活的因素中，体液免疫因素引起的移植肾组织损伤起重要作用。抗移植物抗体可以通过直接和移植物结合，或与炎性／免疫活性细胞的协同作用，造成移植物组织损伤，包括抗HLA抗体引起的内皮细胞的损伤和周围平滑肌细胞的增生。此外，特异性抗HLA抗体和内皮细胞结合后，通过促进一系列纤维生长因子的表达，可加快移植肾组织纤维化的过程。观察移植肾慢性排斥的病理切片不难发现，移植物血管呈现内膜同心圆样增生。这一现象说明两个问题：其一，慢性排斥作用的主要靶细胞是内皮细胞；其二，主要病理变化是血管内皮显著增生，提示持续存在“损伤与修复”过程。这种情况不仅发生在肾移植，而是所有实质器官移植。说明抗体与内皮细胞的结合引起反复的“损伤／修复”循环，导致移植物血管内膜的缓慢增厚和移植物的缓慢失功。由于这个过程是缓慢和隐匿的，因此在临床上常没有明显的症状。

　　Amezaga等采用MICA配型技术，其前瞻性研究发现所有错配MICA均产生抗体，而相容的MICA均无抗体产生，且持续的MICA抗体和慢性移植物失功有关。Zou等最近研究发现，抗MICA抗体与移植肾排斥反应的关系在HLA配型良好、PRA阴性的患者中更为密切，提示在没有抗HLA抗体的情况下，机体对移植物MICA抗原的免疫反应可能对移植肾排斥反应起重要的作用。Zou等研究证实，在血清中补体的作用下，抗MICA抗体可与内皮细胞上表达的多态性的MICA抗原结合，通过细胞毒反应杀伤靶细胞，从而造成移植物的损伤。相关研究表明，抗MICA抗体与移植肾的排斥和存活密切相关。Zou等通过对排斥过程中的肾脏洗脱液的研究发现部分移植肾排斥患者的肾脏洗脱液中只检测出抗MICA抗体，而没有抗HLA抗体，提示MICA抗体可能参与排斥过程中的病理变化。实验显示，慢性排斥组的抗MICA抗体阳性率显著高于移植肾功能稳定组(47.1％和19.2％，P＜0.05)，在抗MICA抗体阳性的慢性排斥患者中，有7例未检测出抗HLA抗体。此外，通过对比不同抗体组术后相同时间的血肌酐水平也发现，抗HLA和MICA抗体均阳性的患者移植后血肌酐值显著高于抗体阴性患者，亦高于抗HLA抗体或抗MICA抗体阳性的患者，抗HLA和MICA抗体同时存在时可导致比抗HLA抗体或抗MICA抗体单独存在时更快、更明显的损伤，造成移植肾功能减退。通过以上结果可以看出，在排除了抗HLA抗体对移植肾功能的影响后，抗MICA抗体可能是影响移植肾长期存活的另一个重要原因。

　　体液免疫是影响移植肾长期存活的关键因素之一，抗HLA抗体介导的体液性排斥反应在诱发慢性移植肾排斥中发挥了重要作用。同时，抗MICA抗体可与内皮细胞上表达的多态性MICA抗原作用，也可导致移植物的慢性损伤。动态监测患者的抗HLA和MICA抗体情况，对有高危因素的受者，及时调整免疫抑制xx方案可能有助于预防CHR的发生和发展，改善移植物长期存活。

作者单位：南方医科大学附属珠江医院器官移植科，广东省广州市 510282；广东省自然科学基金资助项目(06024438)

来源：《中国组织工程研究与临床康复》2009年笫13卷第5期