资料与方法

1．病例选择：2004年2月－2007年4月，本院门诊就诊或住院的122例慢性乙型肝炎（CHB）及乙型肝炎肝硬化患者，均符合《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[1]。排除重叠感染甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及人类免疫缺陷病毒；排除妊娠、脂肪肝、自身免疫性肝炎等。所有患者接受拉米夫定xx12～24个月。

2．血清HBV DNA及肝功能检测：患者在口服拉米夫定前及xx后3、6、12、18、24个月测定血清HBV DNA。仪器为罗氏荧光定量PCR仪，试剂由深圳匹基公司提供，严格按说明书进行操作，＜1×103拷贝/ml为阴性。酶联免疫吸附法测定乙型肝炎标志物，日本OLYMPUS AU 2700全自动生物化学分析仪测定ALT、AST、总胆红素和白蛋白。

3．HBV基因型及YMDD变异株检测：（1）标本采集：患者在接受拉米夫定xx前空腹采集静脉血3ml，4h内2000r/min离心15min，吸取血清 -70℃保存，用于检测HBV基因型及YMDD变异株；拉米夫定xx后HBV DNA定量下降又反弹升高，且血清HBV DNA＞1×104拷贝/ml时，再次进行YMDD变异检测，由浙江大学医学院传染病研究所协助完成。（2）引物设计：HBV基因型及YMDD变异株的基因检测采用基因测序的方法完成，根据我国HBV基因型特点，从美国生物技术信息中心的基因文库中查找出HBV全基因序列，再找出S基因和P基因的高度保守区，设计出相应引物。HBV基因型上、下游引物序列分别为5′-CTACTGTCTC ASCCATATCG-3′和5′-CCCAATACCACATCA TCC-3′。YMDD变异HBV基因上、下游引物序列分别为5′-CTCCAATCACTCACCAAC-3′和5′-GGG TTTAAATGTATACCCA-3′；由上海生物工程公司合成。（3）聚合酶链反应（PCR）：HBV DNA模板采用常规的碱裂解法提取，PCR反应体系X1、X2各1μl（25pmol/L），10mmol脱氧三磷酸核苷1μl，25mmol MgCl2 4μl，10×缓冲液5μl，Taq酶2.0～2.5U，加无菌去离子水至50μl，以上试剂均购自美国Promaga公司。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min。（4）PCR产物纯化：按Qiaquick PCR产物纯化试剂盒（购自美国Qiagen公司）说明书进行。（5）ET末端荧光标记测序：ET末端标记测序试剂盒购自美国Amersham Bioscience公司，按说明书操作，在MegaBACETM500测序仪上测序，测序反应结束后，所获DNA序列与DNA start上的HBV全基因序列通过xxxx进行分析，确定其基因型及YMDD变异情况。

4. 统计学处理：数据均采用SPSS15.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差表示。率的比较用卡方检验及确切概率法，两组均数之间比较采用独立样本t检验，有序变量之间的比较采用秩和检验。

结    果

1．一般情况：在xx过程中，部分患者因经济原因终止xx，部分患者未能定期随访或采血时xx未满1年，余下53例资料齐全的患者，其中男50例，女3例，年龄（36.88±9.14）岁，汉族49例，仡佬族3例，土家族1例。

2．xx前后的临床资料：检测结果显示，患者HBV基因型由B、C及B+C基因型构成，B基因型占56.6%（30/53），C基因型占41.5%（22/53），B+C基因型1.9%（1/53），未发现A、D、E、F、G、H基因型。拉米夫定xx前有1例患者发生P基因突变。拉米夫定xx后血清HBV DNA下降又反弹的患者中，18例检出YMDD变异株，其中用药1年内变异率为15.1%（8/53），用药2年变异率34.0%（18/53）。

3．YMDD突变模式与HBV基因型的关系：拉米夫定xx后发生YMDD变异的18例患者中，B基因型变异率26.7%（8/30），C基因型变异率40.9%（9/22），二者差异无统计学意义（χ2＝1.170，P＞0.05）；B+C基因型1例发生变异（表1略）。

4．YMDD变异与临床相关因素分析：拉米夫定xx后，变异组与未变异组在性别、民族、乙型肝炎家族史及HBeAg阳性/阴性方面差异无统计学意义（P值均＞0.05）。而病程≥2年组与病程＜2年组的变异率分别为43.2%（16/37）和12.5%（2/16），差异有统计学意义（χ2＝4.707，P＜0.05）；年龄＜35岁组与年龄≥35岁组的变异率分别为50.0%（13/26）和18.5%（5/27），差异有统计学意义（χ2＝5.853，P＜0.05）。YMDD变异检出率，CHB轻度、中度、重度及乙型肝炎肝硬化组分别为33.3%（1/3）、41.4%（12/29）、36.4%（4/11）和11.1%（1/9），除CHB轻度组外，随着病情的加重，检出率呈逐渐下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

5． YMDD变异与肝功能的关系：未变异组ALT、AST、总胆红素水平均比变异组高（P＜0.01），而两组白蛋白差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

6．YMDD变异与HBV DNA水平的关系：根据基线HBV DNA含量的不同将53例患者分为＜106拷贝/ml、106～＜107拷贝/ml、107～＜108拷贝/ml、≥108拷贝/ml组，结果YMDD变异的发生率分别为25.0%（2/8）、28.6%（4/14）、37.5%（6/16）、40.0%（6/15），随着HBV DNA含量的增加，变异检出率呈上升趋势，但差异无统计学意义（χ2＝0.801，P＞0.05）。

讨    论

拉米夫定的耐药问题日益受到关注。本研究结果显示，遵义地区的HBV基因型主要由B型和C型构成，与报道相似[2-3]。53例患者拉米夫定xx前经基因测序，发现1例存在P基因突变，突变位点为M204I，该患既往未用过抗病毒药，表明部分患者在接受拉米夫定xx前体内就已存在YMDD变异株。拉米夫定xx后18例检出YMDD变异株，用药1年和2年的YMDD变异率分别为15.1%和34.0%，与报道接近[4]。说明YMDD变异的发生随xx时间的延长而增加。通过对血清HBV P基因序列分析，发现本地区突变类型有rtL180M/M204V、rtL180M/M204I、rtM204I、rtL180M四种，在B、C基因型中，C区rtM204V全部合并rtL180M突变，与以往的报道相似[5]。C基因型的突变率高于B基因型，C基因型中rtL180M/M204V联合突变及rtL180M/M204I联合突变也明显高于B基因型，C基因型中未见点突变，而rtM204I、rtL180M的点突变仅见于B基因型，提示拉米夫定相关性HBV突变以联合变异率较高，而拉米夫定耐药可能与基因型及P基因突变类型有关，但还有待扩大样本进一步研究。

长期（一般在6个月以上）应用拉米夫定xx出现的YMDD变异可导致患者病情反复[6]。本研究结果表明，患者病程越长，用药后的变异率越高；ALT、AST和总胆红素未变异组高于变异组；随着病情的加重，突变的检出率呈逐渐下降趋势；提示肝损害轻的患者可能更易发生YMDD变异。我们对基线HBV DNA水平与YMDD变异发生的分析发现，随着HBV DNA含量的增加，变异检出率呈逐渐上升趋势，虽然差异无统计学意义，但这可能与病例数太少有关。而且在我们xx的病例中，HBV DNA含量＜105拷贝/ml者，无YMDD变异发生。说明拉米夫定xx时HBV DNA高的患者，可能发生YMDD变异的风险较大。还有4例患者虽有血清病毒学突破，但未检测到YMDD变异株，是否存在HBV其他位点的突变，值得探讨。

HBV发生YMDD变异的可能相关因素很多，由于本研究是在拉米夫定xx前及xx过程中HBV DNA定量下降又反弹时进行YMDD变异检测，了解变异与临床的关系，故未能观察YMDD变异动态变化过程，这还有待研究。

参  考  文  献

[1]Chinese Society of Hepatology and Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association. The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 881-891. (in Chinese)

中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.中华肝脏病杂志,2005,13:881-891.

[2]Zhou JL, Wu SP. Effects comparison of lamivudine therapy for hepatitis B virus genotypes B and C. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2004, 12: 489-490. (in Chinese)

周建良,吴诗品.拉米夫定xx乙型肝炎病毒B、C基因型疗效比较.中华肝脏病杂志,2004,12:489-490.

[3]Wang YG, Zhu WJ, Yang XL. Investigation of the relationships between HBV YMDD variation and its genotypes. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 193, 197. (in Chinese)

王义光,朱武军,杨兴林.贵阳地区乙型肝炎病毒YMDD变异与基因分型.中华肝脏病杂志,2005,13:193,197.

[4]Chang TT, Lai CL, Chien RN, et al. Four years of lamivudine treatment in Chinese patients with chronic hepatitis B. J Gastroenterol Hepatol, 2004, 19: 1276-1282.

[5]Li MW, Chen Z, Shao JB, et al. Analysis of reverse transcriptase L180M and reverse transcriptase M204V/I mutation in HBV p gene among the lamivudine resistants. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 2005, 23: 176-177. (in Chinese)

李敏伟,陈智,邵骏斌,等.拉米夫定耐药者HBV P基因rtL180M和rtM204V/I突变分析.中华传染病杂志,2005,23:176-177.　

[6]Lim SG, Wai CT, Rajnakova A, et al. Fatal hepatitis B reactivation following discontinuation of nucleoside analogues for chronic hepatitis B. Gut, 2002, 51: 597-599.