20.植物基因组DNA提取的原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三xxx化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 21.细胞提取液中包含的溶液及作用 细胞提取液: 1. 100mmol/L Tris.HCL pH8.0 （缓冲液，保护DNA） 5mmol/L EDTA pH8.0 （离子螯合剂，保护DNA） 500mmol/L NaCl 1.25% SDS （表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来） 1mol/L β巯基乙醇 （抗氧化剂以降低植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响） 2. 5mol/L KCl （高盐环境，利于DNA沉淀） 22.PCR扩增基因的基本原理 原理类似于DNA的xx复制过程。人工合成与待扩增的DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可将目的DNA扩增上百万倍。3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增10 6-10 9倍。 23.外源基因在大肠杆菌中的诱导表达的实验原理 将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代—B—D—半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。 24. 重组子鉴定的方法 （1）利用xxx初步筛选 （2）利用蓝白反应初步筛选 （3）酶切方法 （4）PCR方法 （5）测序方法 其中方法1，2方便快捷，但假阳性较高；方法3，4是常规方法，也存在假阳性；方法5最可靠，但费用较高。 25. 简述蓝白筛选的原理 许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当无外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子 |
