一、受检者状态的影响

受检者的状态， 如被测者生理变化、饮食改变、环境因素、服用xx等引起变化，在采集血标本时若未注意到这些因素也会对结果做出错误的判断。例如剧烈运动和月经期纤溶活性增高，高脂肪食物造成血脂升高可抑制纤溶活性，吸烟可使血小板聚集性增高，饮酒可抑制血小板聚集性。口服避孕药可增加凝血活性、降低纤溶活性，ticlopidine、阿司匹林等抑制血小板功能，肝素和口服抗凝剂等抑制凝血机制，尿激酶（UK）和葡激酶（SK）等可促进纤溶功能等。目前国内应用这些xx者较多，均应注意。

在实验研究中应用动物血标本，除一般注意事项外，要明了种属差异，尤其在筛选xx和用动物模型进行药理学研究时更应特别注意。

二、标本采集的影响

标本必须按照规定方法采集（详情参照NCCLS H2l-A2文件，1991），以保存凝血因子的全部特性，严格防止凝血因子和血小板被xx。

（一）采血方法 采血前首先要确认病人的身份，并在容器上注明病人的姓名、性别和病历号，然后再次确认，若可能的话，对于多次反复采血的病人xx在同一条件下采血，如病人处于静息状态的早晨或早餐前。对于大多数止凝血试验xx采用双筒注射器采血，但不能使用血气用注射器，因内含肝素会使凝血试验的结果延长。通常，第一管血液用于其他化学试验，第二管血液用于止凝血项目的检验。另外，止血带不应扎得太紧，xx不要超过5分钟，并应强调采血顺利，若采血速度缓慢或采血困难，会xx凝血机制，使凝血因子活性增高、血小板假性降低。为保证实验结果的准确性，xx采用硅化或塑料注射器，其容量误差要求小于10％。针头必须采用2l号以上（外径0.8mm以上），儿童可用23号。

采完血后应拔掉针头，沿管壁将血液缓缓注入试管，要避免产生气泡，因为泡沫的产生可使纤维蛋白原、因子V和因子Ⅶ变性。然后迅速将血液和抗凝剂轻轻的颠倒混匀，避免用力振荡而破坏凝血蛋白。

（二）标本的贮存 血液要求采集于塑料或硅化试管中，并采用塑料移液管分离血浆。血浆xx贮存在塑料或硅化、带塞子的试管中，因为玻璃可以xx凝血过程，影响试验结果。未加塞子的试管放置室温会使血液中的CO2丢失，PH增高，使凝血酶原时间（PT）或活化部分凝血活酶时间（APTT）的结果延长。全血贮存在4~10℃不超过2小时，xx在1小时内分离血浆。富血小板血浆（PRP）要求在室温20~25℃下，以200~400g离心分离10分钟，我国采用800rpm，离心5分钟分离。

在室温22~24℃下，富血小板血浆可存放3小时。大多数凝血试验采用乏血小板血浆，应以1000g以上离心20分钟，我国采用2000~2500rpm，离心30分钟分离，以去除全血中的血小板第3因子（PF3）、血小板第4因子（PF4）和某些凝血因子。乏血小板血浆在室温22~24℃下可存放2小时，不同存放温度和时间对凝血因子活性的检测会有不同程度的影响，尤其是对因子VIII、因子IX和因子XI活性会有较明显影响。

总的看来，冷冻血浆中的凝血因子在越低温度下越稳定。全部试验不能在4小时内完成，应将血浆分装在小试管（0.5~1.0ml）中快速冷冻，贮存于-20℃或-70℃冰箱中。若不冷冻保存可使凝血因子活性异常，导致试验结果延长，而冷冻过的标本不能再次冷冻，否则结果会不准确。

冷冻血浆融化时，不能在室温中让其自然融化，这样会使纤维蛋白原析出和凝血因子消耗。应将盛冷冻血浆的容器置37℃水浴中，并轻轻摇动，使其迅速融化。

用于DNA分析标本，可以用枸橼酸钠或EDTA抗凝，采血量l0ml，离心后去除血浆，留取500ul血浆，然后取白细胞、血小板和红细胞层混合液500ul移至冷冻管中，-70℃或-80℃保存。

（三）标本的运送 止凝血检验标本xx在室温下运送，因为低温会损伤血小板、活化因子VII和因子XI，使PT和APTT结果缩短。但是，有些止凝血检验，如β-血小板球蛋白、血小板第4因子和部分凝血因子检测标本，要求在4℃以下运送，防止因子V和因子Ⅱ降解。有些检测，如测定t-PA活性和抗原、PAI-1抗原时，要求稳定血中的血小板，标本采集后避免体外活化纤溶酶原。

三、抗凝剂与检测试剂盒的影响

（一）抗凝剂

1、抗凝剂 常用抗凝剂有0.109mol/L枸椽酸钠、26.86mmol/L EDTA-Na2和0.1mol/L草酸钠等。应用这些常用抗凝剂对实验结果有影响。用上述抗凝剂分别与血液严格按1:9抗凝，平行测定3次取其结果的均值。研究表明，在标本采集后的15分钟因子V活性就可降低。另外，采集于枸椽酸盐溶液中的标本对肝素敏感性高于草酸盐溶液的标本，这对于应用肝素的病人做APTT试验作为实验室监测就很重要。凝血试验一般推荐的枸椽酸钠抗凝剂的浓度是0.109mol/L或0.129mol/L（即3.2％的Na3C6H5O7·2H20溶液或3.8％Na3C6H5O7·5H2O溶液），抗凝剂与血液比例严格按1: 9。有研究表明，血细胞比容45％的病人，以抗凝剂与血液比例分别为1: 9和1: 5采血，其PT的结果分别为11.7秒和18.7秒，存在显著差异。不应使用变质的枸椽酸盐溶液，否则会使PT、APTT试验的结果缩短。研究也表明，非缓冲枸椽酸钠溶液pH若＞8.0，可破坏贮存标本的硅化试管的硅层，同时也破坏因子V和因子Ⅷ的活性，从而影响实验结果，所以xxpH条件为5.8。

着重指出，血细胞比容（Hct）的高低能引起血浆与抗凝剂之间比例的变化。所以当Hct增高>55％或<25％时，务必用MacGann推荐的公式计算抗凝剂的用量，公式如下：抗凝剂的用量(m1)＝0.00185×全血量(m1)×［1-Hct（%）］。否则检测结果不可信。丛玉隆等研究显示，血细胞比容(Hct)增高的病人因抗凝剂含量过高可使PT、APTT结果延长；Hct减低的病人因抗凝剂含量过低可使PT、APTT结果缩短。

2、抗凝剂+抗聚剂 已证实，枸橼酸钠抗凝剂不能xx抑制血小板活化，活化血小板会释放β-TG、PF4、vWF和PAI等，所以测定这些因子应选用抗凝剂+抗聚剂的抗凝剂。通常选用CTAD液［内含：枸橼酸钠0.11mol/L、茶碱（theophylline）l5mmol/L、腺苷(adenosine)3.7mmol/L和潘生丁(dipyridamol)0.198mmol/L]，其中腺苷作用是活化腺苷酸环化酶，增加血小板内环磷酸腺苷(c-AMP)浓度，减少体外血小板活化；茶碱和潘生丁通过抑制磷酸二酯酶的活性，在一定程度上能阻止c-AMP的降解；潘生丁还能阻止红细胞摄入腺苷，从而有效的增加血小板腺苷应用量，活化腺苷酸环化酶，抑制血小板聚集和α颗粒内容物的释放。CTAD抗凝的优点，采血后血小板很少活化，且保存时间可超过15小时，这很实用。

3、抗凝剂+抗纤溶剂 在溶栓xx的实验室监测中，若用常用抗凝剂会使纤溶系统持续xx可致纤维蛋白原及其降解产物(FDP)的定量比现差异。应该使用“抗凝剂+抗纤溶剂”的抗凝剂，抗纤溶剂可选用抑肽酶，它可以抑制激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血因子和纤溶活性，能xx的测定纤维蛋白原，但会引起凝血酶时间(TT)的延长。

（二）检测试剂 

目前，商品化的凝血活酶和部分凝血活酶试剂的品种繁多。因各种凝血活酶试剂对因子Ⅶ的敏感性不同，故导致PT检测的结果也不相同；同样，活化部分凝血活酶试剂对因子Ⅷ、因子Ⅸ的敏感性不同，故导致APTT检测的结果也不相同。因此，检测试剂的选择应掌握下列原则：

1、根据试剂的重复性和敏感性，按照实验操作方法的要求选择合理的试剂。以APTT为例，APTT试验通常以磷脂作为接触表面，用白陶土、硅藻土或鞣花酸作为xx剂，这些xx剂对肝素、狼疮抗凝物、因子Ⅷ和因子Ⅸ的敏感性各不相同，在检测中就应根据不同的对象选择合理的xx剂。

2、按照仪器性能选用匹配的试剂，某些凝血活酶和活化部分凝血活酶试剂不适用于部分仪器：如浑浊的或含颗粒的凝血活酶和活化部分凝血活酶试剂就不能用在光学法判断终点的仪器上，有些试剂为了保证其中的颗粒处于悬浮状态，在使用前必须充分混合。

3、使用商品试剂必须严格遵循产品说明，用于口服抗凝剂监测的PT试剂必须按WHO的要求进行标化，用国际参照制剂校准凝血活酶，提供国际敏感度指数（ISI），结果以国际标准化比值（INR）报告。例如，同一标本在两个实验室分别用ISI为2．8和1．2的组织凝血活酶试剂检测，其PT的结果分别为20.5秒和42秒（正常对照值为12秒）；凝血酶原时间比值（PTR）分别为1.71和3.50，上述两种表示PT结果的方法相差非常悬殊。但是，经过计算INR见其结果却都在3.0~4.5范围内，口服抗凝剂的用量属于同一水平，无显著差异。

（三）正常对照血浆 

许多实验都需要正常对照，以避免实验操作造成的误差。正常对照血浆要求采集20份以上，年龄在18~55岁间的健康男女个体，删除服药者，须在平静状态下采血。血液经抗凝离心后，分离血浆等量混匀，分装小瓶，冻存于-80℃备用或冷冻干燥。

（四）标准品 

标准化是质量控制的重要组成部分，方法标准化对不同的实验室来说是有困难的。为了使检测结果在同一实验室或不同实验室的不同时期有可比性，就要使用标准品。WHO已建立了十多种血栓与止血的国际标准品，如β-TG（83/501）、PF4（83/505）、vWF（87/718）、蛋白C（86/622）、t-PA（86/670）、FVIII（80/511）、AT-III（72/1）、HBPM/LMWH（85/600）、纤维蛋白原（89/644）等，可以选用。

四、设备和仪器的影响

（一）设备的影响检测所用的设备，主要是试管、注射器、离心机和温育箱等，现以不同品种的试管对测定结果的影响为例说明。

有人取10份用0.109mol/L枸椽酸钠抗凝的血样本，每份分别用硅化试管、塑料试管和普通玻璃试管盛装，平行测定3次取检测的均值，结果见表6。实验结果表明，以硅化试管为xx，凝血因子损耗最少；塑料试管除因子Ⅻ与硅化试管有显著性差异（P<0.01）外，其余差异不显著（P>0.05）。普通玻璃试管最差，与硅化试管的差异显著(P<0.05)。因此，在检测出凝血试验中，要求使用硅化试管或塑料试管，不用普通玻璃试管。

（二）仪器的影响 目前多种自动化的仪器，广泛应用于检测出凝血试验。

仪器的检测原理有

①光学法（比浊法）；

②生物化学法（比色法）；

③免疫学法（透射比浊法、散射比浊法和胶乳比浊法）；

④干化学技术法；

⑤超声分析法等。

不同品牌和不同原理的仪器对检测的结果也有不同。有研究表明，在ACL、Cobas Fibro和Coag-a-Pet三台血液凝固分析仪上，使用同一种ISI为1.12的Thromborel S试剂，测定PT的正常值分别为10.7秒、12.1秒和11.0秒，但若用同一ISI值计算INR，得出数值也存在不同程度的差异。所以，近年有人提出区域性ISI（Local ISI）的概念，认为每台仪器上使用的凝血活酶试剂都应有特定ISI值，而不应使用厂商标定的ISI值，重新标定ISI值的做法是购买标有INR的冻干血浆，然后在自己所用的仪器上再标定凝血活酶试剂的ISI值，这样才能使病人INR的结果具有可比性和可信性。

五、实验方法的影响

理想的实验方法要求准确性和精密度较好，又简便、快速能适合常规应用：因所用实验方法的不同，其所得的结果也可不相同。例如，测定血浆纤维蛋白原的方法可归为四类，它们各具优缺点，目前推荐用Clauss（凝血酶凝固时间法）法。

1、功能测定法 又可分为测重法、酚试剂比色法、紫外光度法、测氮法、浊度法和凝血酶凝固时间法等。这类方法的优点是有凝血功能的纤维蛋白原，又称为可凝固蛋白（clottable protein），故特异性较好。方法可简可繁，常规使用中，多采用较简便的C1auss法。据1975年美国调查，1939个临床实验室中，用此法者占1824家（94%）。

2、理化测定法 又可分为盐析法（用亚硫酸钠、硫酸铵或氯化钠盐析，用蛋白质显色或比浊法测定），热变性沉淀法和电泳法等。这类方法都比较简单、快速，但缺点是本法的特异性不高。所测的不是有凝固功能的纤维蛋白原，可能包括部分的降解产物和/或其他蛋白。而电泳法又太繁琐，不适于常规工作。

3、免疫学测定法 是将纯纤维蛋白原作为抗原免疫动物，制成多克隆或单克隆抗体。然后用免疫胶乳、被动血凝或反向血凝、单向免疫扩散、火箭电泳以及ELISA等方法测定。优点是方法相对简便，但缺点是所测的不仅是可凝固的纤维蛋白原，可能包括了它的降解产物，也可能包括了异常纤维蛋白原(dysfibrinogens)。

4．PT-Der法 即凝血酶原时间（PT）衍生纤维蛋白原法。本法的理论依据是当PT测定完成时，全部纤维蛋白原均变成纤维蛋白，其形成的浊度与纤维蛋白的含量成正比，可由浊度直接推算出纤维蛋白原的含量。当血浆纤维蛋白原含量在正常范围时，PT-Der法与经典的clauss法无显著差异或略高于clauss法；但当纤维蛋白原减低时，PT-Der法往往偏高（P<0.00l），故此法用于纤维蛋白原减低者应慎重。有人用clauss法、双缩脲法和PT-Der法对纤维蛋白原含量作了比较，结果是：双缩脲法在纤维蛋白原正常组（2.0-4.0g/L，n＝32）、纤维蛋白原增高组（>4.0g/L，n＝8）和纤维蛋白原减低组（<2.0g/L，n＝29）均显示测定值偏高。然而，PT-Der法在正常组与Clauss法相比，无差异（P>0.05）；但是增高组和降低组均有显著差异（P<0.05、P<0.01）。

六、操作者技术的影响

操作者的技术，有的熟练，有的生疏。有人比较了一个技术熟练的专业技术人员与一个技术生疏的实习学生，对同一份标本，用同样的试剂、仪器和方法，检测PT、APTT、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(Fg)，其结果出现了差异。因此，对技术熟练者精益求精，不断提高；对技术生疏者，应加强上岗前培训，不断操练，由生疏变熟练。

七、血小板聚集试验的影响因素

血小板的相互粘附则为聚集。体外多种物质如ADP、肾上腺素、胶原、凝血酶和花生四烯酸等均可引起血小板聚集。在富含血小板的血浆（PRP）中加入上述诱导剂来检测血小板的聚集功能即为血小板聚集试验。影响血小板聚集试验的因素有：

1、诱导剂 常用的二磷酸腺苷（简称ADP）、肾上腺素、胶原、凝血酶、5-HT和花生四烯酸等。不同诱导剂以及不同浓度均可导致不同结果。

由于不同诱导剂引起的聚集机制不同，因此不同诱导剂的应用反映了血小板不同的缺陷。根据不同的实验目的选用不同的诱导剂也很重要。我们曾对服用阿司匹林的受检者的血浆用花生四烯酸、ADP、胶原和瑞斯托霉素四种不同诱导剂进行血小板聚集功能的测定，发现最敏感的是花生四烯酸，而瑞斯托霉素则没有反应。

ADP的浓度影响着血小板聚集的速度和强度，低浓度产生可逆性聚集，高浓度ADP产生不可逆性聚集。一般报道的xx浓度与临界浓度为3×10-8mol/L~3×10-6mol/L。胶原引起的聚集是通过血小板释放引起的。在加入胶原后有一段明显的延迟相，然后才有透光度急剧的增加。它的活性随原料和制作方法不同可有很大差异。肾上腺素可引起双相型聚集曲线，第一相变化与肾上腺素浓度有关，第二相变化与ADP释放有关，其作用浓度为5×10-8mol/L~5×10-6mol/L。

2、PRP中的血小板数 PRP中的血小板决定了血小板的碰撞率，影响到聚集的速度、程度和性质。因此测定中必须固定PRP中的血小板数，一般选用200×109/L~500×109/L范围。不过这种影响在ADP中较明显，用肾上腺素时小些。

3、搅拌条件 指搅拌速度和搅拌的形状，二者均影响血小板碰撞率，搅拌速度为120rpm，不出现聚集，500rpm时，聚集程度虽与1000rpm时相同，但聚集速度较慢。目前使用的血小板聚集仪搅拌速度都固定为1000rpm，搅拌棒的粗细长短均已选定。

4、采血后测定时间 采血后不及时测定会影响聚集强度和速度，特别是释放反应。引起聚集反应下降的原因可能与一种“血浆不稳定”性因素增加有关。如采血后30~120分钟内的PRP，在低浓度ADP引起的聚集速度和高浓度ADP引起的第一、第二聚集相，解聚速度均有下降。因此应当固定和限定测定时间，一般认为采血后2~3小时测定对结果影响不大。

5、放置PRP的温度 血小板在冷的环境下可发生外形改变及粘附、聚集能力增加，或出现自发性聚集。其原因可能与有利于ADP释放及阻止解聚有关，或是阻止一种原因不明的体外破坏作用以及影响诱导剂作用之故。故血标本采集后置于室温即可。

6、抗凝剂 钙是血小板聚集中重要的因素，由于种种原因造成枸橼酸在PRP中浓度的变化均可影响聚集结果。一般用0.l29mol/L枸橼酸抗凝。

7、pH值 由于病理性的酸中毒或碱中毒，以及由于CO2的弥散使暴露于空气的PRP的PH值变动，均可影响聚集结果。当血浆标本偏酸时，肾上腺素引起的聚集受抑，偏碱性时聚集增强。

8、红细胞的混杂、溶血及血浆脂类 这类因素的存在主要是降低悬液的透光度，从而掩盖血小板聚集变化。当PRP中混入的红细胞过量时，即可产生这种影响。

9、白细胞 白细胞对ADP、5-HT和凝血酶引起的聚集和解聚有影响，它能迅速灭活ADP。

10、月经和妊娠 xxxx对聚集和释放功能有影响，如妊娠时第二相速度加快，排卵期时ADP和肾上腺素引起的第二相却很常见，而经期和黄体期则罕见。

11、种属差异 各种哺乳动物的血小板聚集特性及对诱导剂的反应是十分不同的。而且血浆对外源性ADP聚集活性速度也有种属差异。此外，不同地区人的血小板聚集功能也不同。

12、抑聚剂 有许多种抑聚剂，如腺苷、前列腺素、阿司匹林、潘生丁、保泰松和低分子右旋糖苷等，其中有的xx抑制聚集第一相，有的抑制聚集第二相，有的仅在大剂量时出现抑制作用。

综上所述，影响血栓与止血检测因素众多，不仅临床医师需要了解，特别是检测人员更需要熟知，做到在检测的全过程中，处处和环环都必须倍加注意，才能保证检测结果有xx的准确性和可靠性。